Ventilação a pressão controlada para induzir lesão pulmonar aguda em ratos

Observações gerais: Todas as operações devem ser realizadas em um microscópio de dissecação vertical (Olympus, SZX10 com Z-Axis Mensagem Crank com STU2 Fique lança Stand) e usando um coagulador cirúrgica (11). Os grupos experimentais devem ser combinados da melhor forma possível na idade e peso para garantir a comparabilidade dos resultados. Administração de temperatura, pressão arterial anestesia, e fluido deve ser estável por toda parte. 1. Anestesia e preparação traquéia Use camundongos C57BL / 6 que são pelo menos 10 semanas de idade e tem um corpo de 22-25 g. Induzir a anestesia com pentobarbital sódico na dose de um ip 70 mg / kg peso corporal (6). Manter a anestesia com cerca de 10 mg / kg / h de sódio pentobarbital. Seja cauteloso com overdose uma vez que este pode reduzir significativamente a pressão arterial. Re-dose de pentobarbital – mesmo depois de horas-pode levar a um aumento severo dos níveis plasmáticos. Após indução da anestesia, os ratos segura em posição supina com as extremidades superiores e inferiores anexado à mesa com uma fita e uma sutura presa aos tornozelos. Faça o mesmo para a cabeça, usando os dentes. Restrição suficiente é importante para uma intubação de sucesso e uma cirurgia bem controlada. Antes da cirurgia, cobrir o mouse com óleo mineral para reduzir o risco de alergia cabelo mouse. A fim de assegurar que a temperatura corporal permanece estável cobrir os ratos com filme de alimentos disponíveis comercialmente. Camundongos colocar em uma mesa aquecida com temperatura controlada (RT, Effenberg, Munique, Alemanha) com uma sonda termômetro retal ligado ao controlador de retorno térmico para manter a temperatura corporal a 37 ° C. Expor a traquéia cirurgicamente. Dissecar laterais e dorsal da traquéia do tecido conjuntivo e coloque duas fio de seda 3,0 cirúrgico (aparelho Harvard, EUA) a cada 10 cm de comprimento por baixo da traquéia. As suturas devem ser de aproximadamente 1 cm. Cuidadosamente inciso traquéia 3-4 mm abaixo da laringe entre duas cartilagens circular usando uma tesoura McPherson-Vannas (8 cm, lâmina reta; Instrumentos de Precisão World, EUA). Certifique-se de não causar um sangramento, já que isso pode confundir os parâmetros de resultados. Realizar uma intubação traqueal com cânula de polietileno blunt (INSYTE 22g, Beckton Dickinson, EUA). Insira a ponta da cânula de polietileno em um ângulo de 85 graus na traquéia. Em seguida, incline a cânulas por isso está de acordo com a luz traqueal. Lentamente avanço do tubo mais abaixo da traquéia até a ponta da cânula desapareceu na abertura do tórax. Fixar o tubo nesta posição com o fio de seda dois cirúrgica colocada dorsal da traquéia (ver 1.4). 2. Técnica de ventilação mecânica da lesão pulmonar induzida Ligue o tubo a um ventilador. Para induzir a lesão pulmonar usamos uma pressão técnica de ventilação controlada usando um C 900 Servo da Siemens (DRE Veterinária, EUA). Animais serão ventiladas com pico de pressão inspiratória de 45 mbar, freqüência de 80 respirações / min e uma pressão positiva expiratória final de 0-3 mbar com uma FiO 2 = 1,0. A inspiração à relação de expiração deve ser de 1:1. Apesar do fato de que o C 900 Servo é construído como ventilador para os seres humanos, a sua utilização em um ambiente de ventilação pressão controlada excelentes trabalhos para a ventilação de camundongos. Monitor de freqüência cardíaca com ECG (por exemplo, Hewlett Packard, B blingen, Alemanha). Certifique-se que a freqüência cardíaca não cai abaixo de 400. Deve-se ver uma mudança do eixo do coração para a direita, quando a ventilação mecânica é instituído como um sinal de aumento da pressão arterial pulmonar decorrente de um aumento na pressão intratorácica. Se o rato se desenvolve bradicardia, verifique a temperatura ea dose do anestésico / concentração. Xylacin / cetamina induz anestesia um coração coração de 250 / min e não é recomendada. Aplique uma reposição de líquidos adequada. Uma infusão com solução salina 0,1 ml / hora através de um cateter arterial ou venosa deve ser realizada antes da ventilação e garantir o arquivamento venosa suficiente. Devido às pressões de ventilação alta o retorno venoso para o coração é prejudicada, o que pode levar a uma queda crítica da pressão arterial média. Além disso, uma solução salina em bolus de 500 mL pode ser dado ip antes da cirurgia. Colocar um cateter na artéria carótida para a gravação contínua da pressão arterial (27). Fixe o braço para o corpo antes de começar a dissecção da artéria. A artéria carótida é exposta através de dissecção romba da musculatura paratraqueal. Após a exposição ainda mais cuidado e evitar de qualquer trauma tecidual (particular do nervo vago), um cateter é inserido dentro do vaso usando duas suturas e uma braçadeira pequena (37). Isto irá expor um longo segmento da artéria. Coloque uma ligadura no final da artéria carótida. Anexar um maior aperto para o final da sutura para obter ª tensão ou fixarsutura e para a mesa usando fita. Coloque outro sutura ao redor da artéria e dissecar a artéria até o fim distal. Aqui, colocar uma braçadeira de pequeno porte. Use uma tesoura para cortar micro de uma pequena abertura na diagonal dentro da artéria. Segure a abertura com uma pinça fina (Dumont, WPI) e avançar o cateter de tamanho apropriado com as mãos / fórceps. Faça um nó com o seu segundo e segura de sutura da artéria. Solte a braçadeira e avançar o cateter ainda mais. Fixe o cateter com vários nós e fita. Alternativamente, o cateter de artéria carótida pode ser realizado no final do experimento para coletar amostras de sangue arterial para gasometria. 3. Recuperação de amostras de tecido Após 3 horas de ventilação mecânica, serão colhidas amostras para avaliar a extensão da lesão pulmonar. Recomendamos coletar lavado brochnoalveolar (BAL), sangue arterial e no tecido pulmonar. Obter LBA, no final do experimento. Depois de aprofundamento da anestesia, lave o tubo traqueal com 1 ml solução salina tamponada com fosfato (PBS). O fluido deve permanecer na traquéia / pulmão por três segundos antes que ele é a recuperação através da seringa conectada. O LBA é snap-congelados em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ° C para análise posterior. Estar ciente de que o volume pode ser recuperado significativamente menor do que 1 ml. Realizar a análise de gases sanguíneos, no final do experimento. A fim de fazer isso, uma incisão deve ser feita logo abaixo do esterno. Segure o esterno com uma pinça e extensão da incisão ao longo da caixa torácica. Em seguida, o diafragma é incisão nas bordas e é cortado a partir as costelas. Agora há uma visão aberta para o mais baixo da abertura do tórax. Levantar o esterno até com uma pinça e abrir o tórax por cortes longos no lado direito e esquerdo (como laterais possível) para que a parede do tórax anterior completa está ligado-alas. Isto deve ser feito, enquanto o animal ainda é experimental ventilação mecânica. O ventrículo esquerdo é perfurado usando um 27 ½ G agulha e análise do sangue arterial é realizada utilizando o Sistema i-STAT (Abbott, EUA). Se a gasometria arterial deve ser realizada, uma BAL não pode ser obtida, uma vez que este será um fator de confusão significativa para os resultados. Em alternativa ao método acima, as amostras de sangue arterial podem ser coletadas através do cateter de artéria carótida. No entanto, isto deve ser feito antes do LBA é obtido. Especiais de consumo os pulmões em bloco, puxando-se o coração e cortar a traquéia. Ter um pedaço de tecido pronto para absorver o sangue, de modo que o sítio cirúrgico é visível. Puxe o coração na direção do abdômen e corte cuidadosamente ao longo da espinha para mobilizar todos os órgãos do tórax. Corte a aorta, remover os órgãos torácicos e coloque-os sobre uma mesa limpa cirúrgico. Cortar o coração e os vasos principais da amostra de tecido. Certifique-se que não há tecido do timo ainda ligado ao pulmão. Separar os pulmões com uma tesoura e coloque em tubos individuais e encaixe-congelante. Armazenar a -80 ° C para análise posterior. 4. Medição de lesão pulmonar Recomendamos a utilização dos parâmetros seguintes resultados para avaliar a extensão da lesão pulmonar: Realizar um ELISA albumina (Bethyl Laboratories, EUA) e um mieloperoxidase (MPO) ELISA (Hycult Biotecnologia, EUA) para avaliar a extensão da disfunção de barreira e a quantidade de inflamatória células no LBA. Realizar um ELISA MPO também formam o tecido pulmonar. Se wet-a-seco proporção deve ser medida não obtemos LBA e da circulação pulmonar não é lavada (ver 3.3). Medir o peso dos pulmões após a excisão. Em seguida, os pulmões são liofilizadas por 48 h e no tecido pulmonar é medido novamente. Então a relação de wet-a-seco é medido em mg de água por mg de tecido seco (5). Figura 1. Teor de proteínas na BAL em resposta a VILI. Camundongos foram anestesiados com pentobarbital, ventilação mecânica foi instituída e os ratos foram ventilados com pressão controlada configurações (pressão inspiratória de 45 mbar, positiva ao final da exspiratory pressão de 3 mbar, 100% inspirado concentração de oxigênio). Após 0, 1, 2 e 3 horas de ventilação BAL foi colhida eo teor de proteína foi quantificado através de um ensaio de ácido bicinchoninic (ensaio BCA). A mudança relativa do teor de proteínas é mostrado normalizado para 0 horas de ventilação (n = 4 por grupo, * indica p <0,05 comparado ao grupo controle, média ± SEM)