在Sf9细胞，并在海兔感觉神经元PKC移位实时成像
概要
在这段视频中，我们证明在使用PKCS荧光标记的活细胞PKC移位可视化。
Abstract
蛋白激酶CS（PKCS）丝氨酸苏氨酸激酶，发挥核心作用，在规范的多种细胞过程，如细胞的生长和学习记忆。有四种已知脊椎动物中的PKC亚型的家庭：古典PKCS（α，βI，βII和γ），新颖的I型PKCS（ε，η），小说II型PKCS（δ和θ），非典型PKCS（ζ和ι ）。古典PKCS被激活的Ca 2 +和diacylclycerol（DAG），而小说PKCS是由DAG的激活，但独立的Ca 2 +。既不钙2 +和 DAG的非典型PKCS被激活。在海兔californica，我们的模型系统来研究记忆的形成，有三个中枢神经系统特定PKC亚型从每个主要类别之一，即传统的PKC的美国总统轮船我的小说类型我PKC的美国总统轮船II和非典型PKC的美国总统轮船三。 PKCS脂激活蛋白激酶和外信号激活古典与新颖的PKCS已经经常与PKC从胞浆易位到质膜相关。因此，在活细胞中实时蛋白激酶C移位可视化已成为一个宝贵的工具，阐明导致PKC激活的信号转导通路。例如，这项技术已允许我们建立不同的PKC亚型转运不同条件下的调解不同类型的突触可塑性和激活PKC的美国总统轮船II，5 – 羟色胺（5HT）需要DAG和磷脂酸（PA）的生产易位1-2。更重要的是，相同的神经元的能力，可视化多次允许我们，例如，在精致的细节 3 PKC反应来衡量的脱敏。在这个视频中，我们展示了准备的Sf9细胞培养的每一步，海兔感觉神经元的文化已在另一视频第4条所述，表示在Sf9 细胞，并在海兔感觉神经元和PKC的易位的生活成像PKCS荧光标记反应不同的活化剂，使用激光扫描显微镜。
Protocol
Discussion
我们已经描述了一种技术，实时图像PKCS荧光标记的易位在Sf9细胞， 并在海兔感觉神经元。 Sf9细胞提供了一个简单的系统形象PKC的易位，因为培养和转染他们是相当平直向前。相比之下，微量注射海兔感觉神经元需要一些时间来掌握，最多几个月。有关这项技术的困难，包括电极堵塞。过滤注射液和离心它通常会帮助，但有时气泡在电极形成却使。我们发现，使用microloader枪头填补?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是支持由加拿大卫生研究所（CIHR）批准机构韦恩南Sossin。阿玲A.法拉是从全宗德拉RECHERCHE EN桑特魁北克（FRSQ）和康拉德哈灵顿奖学金博士后奖学金获得者。作者想感谢乔安娜探条，玛格丽特黑斯廷斯和玛格丽特Labban与视频拍摄和图形概述帮助马德琳里士满池帮助。
Materials
| Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | Gibco | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | Mattek | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments | TW100F-4 | Use to make microelectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Microelectrode holder | Tool | World Precision Instruments | MPH6S | Use to hold microelectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter | MP-85 | Use to position microelectrode in the three-axis |
参考文献
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
