Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Überblick: Das Protokoll ist in vier Teile aufgeteilt. Teil 1 beschreibt, wie die Fütterung Bakterien vorbereiten. Teil 2 beschreibt, wie der Wurm Kultur vorzubereiten. Teil 3 beschreibt die Lebensdauer des Gastes. Teil 4 zeigt einige repräsentative Ergebnisse, und Teil 5 beschreibt, wie die erforderlichen Lösungen herzustellen. Lebensdauer Experimente dauern mehrere Wochen in Anspruch. Für jeden Schritt des Protokolls Woche, Tag und Uhrzeit des Tages aufgenommen, um die Planung zu erleichtern. Die L4 Stadium (Tag 0) wird als Bezugspunkt für das gesamte Protokoll verwendet. 1. Vorbereitung der Fütterung Bakterien Dieser Abschnitt beschreibt die Vorbereitung der Fütterung Bakterien. Die spezifische E. coli-Stamm verwendet, um C.elegans feed heißt OP50. Vor diesem Protokoll, um eine Kreuzkontamination der Wurm Kultur mit anderen Bakterien zu verhindern, hat die OP50 Belastung gemacht Carbenicillin / Ampicillin resistent 21. Bereiten Sie das OP50 vier vor fünf Tage im Voraus. Alle Materialien in Kontakt kommen mit OP50 müssen steril sein. Tag -7: Donnerstag (Woche 1): Impfen 5 ml TB mit 100 ug / ml Ampicillin und 0,1 ug / ml Amphotericin B mit einem OP50 Kolonie und Inkubation über Nacht bei 37 ° C in einem bakteriellen Schüttler. Tag -6: Freitag (Woche 1). Morgen 8:30 Uhr. Impfen früh, um genügend Zeit für die Kultur bis zur Sättigung zu erreichen Verdünnen Sie die Nacht-Kultur von OP50 1:2000 in 300 ml TB mit 50 ug / ml Ampicillin. Inkubieren Sie die Kultur in einem bakteriellen Schüttler für 8-12 Stunden bei 37 ° C bis zur Sättigung erreicht ist. Nicht in die Kultur zu wachsen länger als 14 Stunden. Übertragen Sie die OP50 in eine sterile, pre-gewichteten Zentrifugenröhrchen. Pellet der OP50 durch Zentrifugation für 10 min bei 3500 rpm (2200 xg) in einer Tischzentrifuge. Überstand verwerfen und wieder aussetzen OP50 Pellet in sterilem Wasser und re-Pellet durch Zentrifugation. Wiederholen Sie diesen waschen zweimal. Nach dem zweiten Waschen, entfernen Sie sorgfältig alle das restliche Wasser. Darf kein Wasser in die Röhre gelassen werden. Wiegen Sie das Zentrifugenröhrchen mit dem Pellet und subtrahieren das Gewicht des leeren Zentrifugenröhrchen, um das Gewicht der Pellets zu bestimmen. Gründlich resuspendieren Sie das Pellet in S-complete zu einer Konzentration von 100 mg / mL. Keine Klumpen überlassen werden sollte. Die Konzentration von 100 mg / mL OP50 auf 2 x10 10 Bakterien / ml entsprechen. Verwenden Sie ein Foto-Spektrometer, um die Anzahl der Bakterien pro ml zu bestimmen, ob die Beziehung zwischen der optischen Dichte und der Anzahl der Bakterien pro ml bekannt ist. Falls erforderlich, die Konzentration der OP50 Fütterung Lösung zu 2 x10 10 Bakterien / ml. Bewahren Sie die OP50solution bei 4 ° C, bis es für den Wurm Kultur verwendet. 2. Erstellung eines Synchron-Worm Kultur Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung des Wurms Kultur. Sein Ziel ist es, ein Alter-Synchron-Bevölkerung von Würmern zu generieren. Alle Materialien in Kontakt kommen mit C.elegans nach der Bleiche Behandlung in Schritt 5 müssen steril sein. Die Platten werden bei 20 ° C, sofern nicht anders angegeben. Tag -6: Freitag (Woche 1), 04.00 Uhr: Transfer der Tiere auf eine frische Platte Nehmen Sie etwa 5-10 Tage alten NGM Teller, auf dem die Mehrheit der Wurm Bevölkerung besteht aus verhungert L1-Larven. Sterilisieren einem Spatel durch kurzes Erhitzen über einem Bunsenbrenner. Lassen Sie sie abkühlen. Verwenden Sie den gekühlten Spatel zum Ausschneiden Agar Stücke von der Platte mit den verhungerten Würmer. Übertragen mehrere dieser Stücke auf eine frische 10 cm NGM-Platte ausgesät mit OP50. Inkubieren für ca.. 65 Stunden bei 20 ° C, bis die Mehrheit der Wurm Bevölkerung besteht aus gravid Erwachsene. Die Zeit, die für die ausgehungerten Tiere L1 in gravid Erwachsenen wachsen kann von Stamm zu Stamm unterschiedlich. Tag -3: Montag (Woche 2) 10.00: Einführung eines synchronen Bevölkerung Sammeln Sie Würmer aus dem 10 cm Platte durch Waschen Sie die Platte mit 5-10 mL sterilem Wasser. Übertragung der Wurm / Wasser-Lösung in einen 15 mL konischen Rohr. Waschen Sie die Würmer durch Zentrifugation 2 min in einer Tischzentrifuge bei 1200 rpm (280 xg). Überstand verwerfen und 10 ml Wasser. Wiederholen. Überstand entfernen und 5 ml frisch zubereitete Bleiche / NaOH-Lösung (2,5 ml Bleiche, 1 mL 10 N NaOH, 6,5 mL H 2 O). Inkubieren für 5 Minuten bei RT, bis die Würmer offenen Bruch. Achten Sie darauf, vortexen jede Minute. Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion unter dem Binokular. Sobald alle Erwachsenen zu lösen, 5 ml M9-Puffer, um die Reaktion zu neutralisieren. Waschen Sie die Eier dreimal mit 10 mL M9-Puffer durch Zentrifugation 2 min bei 2500 rpm (1100 xg). Waschen Sie die Eier einmal mit 10 mL S-complete durch Zentrifugation 2 min bei 2500 rpm (1100 xg). Entfernen Sie den Überstand, 10 ml S-complete und die Lösung in ein frisches 50 mL konischen Rohr. 30 ml S-complete, um ein Endvolumen von 40 mL. Schütteln Sie das Rohr über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Kolbenpendel oder ein ähnliches Gerät. Tag -2: Dienstag (Woche 2), 12:00 Uhr: Seed die Tiere in Platten Unter dem Binokular, zu prüfen, ob die Würmer in der Nacht geschlüpft. Bestimmen Sie die Konzentration von Würmern in der S-Komplettlösung durch Zählen der Anzahl der Würmer in 10 ul Tropfen mit einem Binokular. Graf mindestens 10 Tropfen für jede Probe. Re-suspend die Würmer in einer Konzentration von 80-100 Würmer / mL in S-abgeschlossen. Add Carbenicillin (Bestand 100 mg / mL) zu einer Endkonzentration von 50 ug / mL und Amphotericin B (Bestand 250 ug / mL) zu einer Endkonzentration von 0,1 pg / mL. Schütteln auf einem Kolbenpendel. Wenn die Herstellung größerer Mengen von Würmern, verwenden Sie einen 600 mL Nunclon Kolben mit Filterdeckel. Am 14.30 Uhr fügen Sie die OP50 in Teil 1 bis zu einer Endkonzentration von 6 mg / mL (= 1,2 x10 9 Bakterien / ml) hergestellt. Senden Sie das OP50 bis 4 ° C. Transfer-120 ul der worm/OP50 Lösung in jedes Well einer 96-Well-Platte. Verwenden Sie 96-Well Platten mit transparentem Boden. Vergewissern Sie sich, um die Würmer in der Schwebe zu halten beim Pipettieren. Verschließen Sie die Platte mit einem Tape-Versiegelung auf Kontamination und Verdunstung zu vermeiden. Schütteln Sie die Platte auf einem Schüttler für 2 min und Inkubation für 2 Tage bei 20 ° C, bis die Tiere die L4 Stadium zu erreichen. Tag 0: Donnerstag (Woche 2) vor dem Mittag: Sterilisieren Tiere, indem Fluordeoxyuridin (FUDR) Um die Tiere zu sterilisieren add 30 ul einer 0,6 mM FUDR Stammlösung in jede Vertiefung. Dieser Schritt bringt das Endvolumen in jeder Vertiefung zu 150 ul und reduziert die Endkonzentration des OP50 von 6 mg / ml bis 5 mg / mL (1×10 9 Bakterien / ml). Verschließen Sie die Platte mit Klebeband Versiegelungen und schütteln Sie sie für 2-3 min auf einem Schüttler. Wenn das OP50 war um 2:30 am Tag -2 hinzugefügt, ist es wichtig, dass die FUDR vor Mittag wird hinzugefügt. Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator Tag 1: Freitag (Woche 2): Fügen Sie Medikamente zur Kultur Um 9:00 Uhr die meisten der Tiere sollten gravid und enthalten mehrere Eier jeden. Fügen Sie die Medikamente, deren Wirkung auf die Lebensdauer ist in der gewünschten Konzentration getestet werden. Wenn die Auflösung der Drogen in DMSO die Endkonzentrationen von DMSO sollte nicht mehr als 0,6%, wie DMSO-Konzentrationen höher als 0,6% zu verkürzen C.elegans Lebensdauer. Nach Zugabe des Medikaments, dichten die Platten mit Klebeband Versiegelung und schütteln Sie sie für 2-3 min auf einem Schüttler. Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator Hinzufügen der Medikamente können gelegentlich zu töten ein paar Tiere pro Platte, besonders wenn mit einem anderen Lösungsmittel als Wasser. Verwenden Sie eine inverse Mikroskop für lebende Tiere zu überprüfen. Generell sollte es weniger als 10 tote Tiere pro 96-Well-Platte sein. Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator. Tag 4: Montag (Woche 3): Change Versiegelungen Um frischen Sauerstoff in die Kultur geben entfernen Sie die Versiegelung, warten Sie 1 Minute und verschließen die Platte. Schütteln Sie die Platte für 2-3 Minuten auf einem Schüttler. Wiederholen Sie jede Woche einmal. Tag 5: Dienstag (Woche 3): Add new OP50 zum Verhungern zu verhindern Add 5 ul der 100 mg / mL OP50-Lösung, die in Teil 1 zu jedem der 96 Löcher, um Hunger zu verhindern, wurde hergestellt. 3. Scoring der Lebensdauer. In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie das Überleben der synchronisierten Wurm Bevölkerung von Teil 2 überwacht wird, bis die Tiere starben. Zur Beobachtung der Tiere in den 96-Well-Platten, verwenden Sie einen inversen Mikroskop mit 2x oder 2.5x Ziel. Rekord Überlebensdaten dreimal in der Woche, Montag, Mittwoch und Freitag. Verwenden Bewegung, um festzustellen, ob die Tiere lebend oder tot sind. Starkes Licht, vor allem blaues Licht, induziert die Tiere sich zu bewegen. Entfernen Sie nicht tote Tiere aus dem Test. Gelegentlich kann Tiere, die nicht verschoben hat und tot waren in den vorhergehenden Zählung bestimmt später zu verschieben. Am Tag 0, am Anfang des Experiments zählen die Gesamtzahl der Würmer in jede Vertiefung. Censor Brunnen, die mehr als 18 Tiere aus der Analyse enthalten wie die Tiere in diesen Brunnen nicht mehr genügend OP50 und Effekte der diätetischen Restriktion zeigen. Um die Chance, dass die Tiere schütteln den 96-Well-Platte auf einem Schüttler für 2 min bewegen zu erhöhen. vor dem Zählen. In jedem Zählen Sitzung record date und Anzahl der Tiere, diebewegen, wie lebende Tiere. Bewegung in flüssiger ist viel einfacher als auf festen Medien und kann durch starkes Licht induziert werden. Die Verwendung einer höheren Vergrößerung kann helfen, sehr subtile Bewegungen wie die der Spitze des Pharynx vor Ort. Solche subtilen Bewegungen sind oft die einzige Bewegung in sehr alten Tieren beobachtet. Zurück Platten, die 20 ° C Inkubator Wiederholen Sie Schritt 2-4 alle zwei vor drei Tagen bis alle Tiere tot sind. 4. Repräsentative Ergebnisse. Dieser Abschnitt zeigt ein Beispiel, wie man Aufzeichnungen über die Lebensdauer von Daten durch diese Tests und einige repräsentative Ergebnisse generiert halten. Abbildung 1A zeigt ein Beispiel, wie man Lebensdauer Daten während dieses Tests aufzuzeichnen. Eine Excel-Tabelle wird verwendet, um das Überleben der Populationen in jede Vertiefung zu halten. Für jeden gut ist es in der Platte zu koordinieren, Dehnung, Drogen, Konzentration des Medikaments und die Gesamtzahl der Tiere am Leben am Tag 0 (X0) wird am Anfang des Experiments aufgezeichnet. Stichtag sowie die Anzahl der lebenden und toten Tieren dreimal in der Woche, um das Überleben der verschiedenen Bevölkerungsgruppen in jede Vertiefung folgen. Um die Ergebnisse grafisch, berechnen den Anteil der Tiere am Leben für jeden Tag und Handlung als eine Funktion der Zeit in Tagen. P-Werte zu berechnen mit Hilfe statistischer Pakete wie STATA oder ähnliche Software. Das Medium Lebensdauer von C. elegans ist temperaturabhängig. Abbildung 1B zeigt, dass temperaturabhängige Veränderungen in Lebensspanne genau durch die Mikrotiterplatten basierten Lebensdauer Assay 22 wiedergegeben. Ebenso gibt die Mikrotiterplatte Assay Veränderungen in Lebensspanne von Mutanten berichtet, Lebensdauer, die von Wildtyp N2 Tiere 23-24 25 (Abb. 1C) unterscheiden können. Der Test kann auch verwendet werden, um mehr quantitative Aussagen zu machen. In Fig1D bedeuten Lebensdauer beträgt in Abhängigkeit von der Konzentration Mirtazepine 7 dargestellt. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert Lebensdauer von 7-12 Bevölkerung, jedes Lebewesen in ein anderes auch. Auch wenn die Anzahl der Tiere pro Well ist relativ gering (5-15 Tiere) der Well-to-Well-Variante ist relativ gering, wie aus der Fehlerbalken zu sehen ist. Abbildung 1. Die Mikrotiterbasis Lebensdauer-Test reproduziert Veränderungen in Lebensdauer in der Literatur berichtet. (A) Sample-Daten in eine Excel-Tabelle gesammelt. Während jeder Sitzung Zählen Datum, der gut zu koordinieren und die Anzahl der lebenden und toten Tieren aufgenommen wurde. Zu Beginn des Experiments wurde die Gesamtzahl der Tiere in jeder Vertiefung bestimmt. (B) Survival-Kurve von Wildtyp-(N2) Tiere bei 20 ° C gezüchtet und 25 ° C. (C) Überlebenskurven von Stämmen, die Mutationen, die die Lebensdauer beeinflussen. Alle vier Stämme wurden in parallel bei 20 ° C getestet (D) Dosis-Wirkungs-Kurve von Mirtazepine behandelt N2 Tiere. Mittlere Lebensdauer ist als eine Funktion der Mirtazepine Konzentration aufgetragen. Fehlerbalken zeigen den SEM von 8 Wells pro Zustand. 5. Materials. M9-Puffer, 1000 ml 6 g Na 2 HPO 4 3 g KH 2 PO 4 5 g NaCl 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O Add entionisiertem Wasser auf 1000 mL Autoclave Potassiumphosphate pH 6,0, 1000 ml 136 g KH 2 PO 4 Add entionisiertem Wasser auf 900 ml Der pH-Wert auf 6,0 mit 5M KOH Add entionisiertem Wasser auf 1000 mL Autoclave Trace Metall-Lösung 1,86 g Na 2 EDTA 0,69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O 0,29 g ZnSO 4 ∙ 7H 2 O 0,016 g CuSO 4 1000 mL VE-Wasser Autoklaven und dunkel lagern. S-Basalmedium, 1000 ml 5,9 g NaCl 50 ml 1 M Kaliumphosphat, pH 6,0 1000 mL VE-Wasser Autoclave Lassen Sie die Lösung abkühlen lassen und dann 1 mL 5 mg / mL Cholesterin (gelöst in Et-OH). Kaliumcitrat 1M, 1000 ml 268,8 g Trikaliumcitrat 26,3 Zitronensäuremonohydrat Add 900 ml VE-Wasser Der pH-Wert auf 6,0 mit 5M KOH Add entionisiertem Wasser auf 1000 mL Autoclave S-Vollmedium, 1000 ml 977 ml S-basalen 10 mL 1M Kaliumcitrat pH 6 (steril) 10 mL Spurenmetalle Lösung (steril) 3 ml 1M CaCl 2 (steril) 3 mL 1M MgSO 4 (steril) NGM-Agar 3.0g NaCl 2,5 g Pepton(Aus Casein-, Bauchspeicheldrüsen-Digest) 17g Agar Add entionisiertem Wasser auf 975 ml und einen Rührstab Autoclave Nach dem Autoklavieren abkühlen auf 55 ° C und fügen Sie die folgenden Komponenten: 0,5 ml 1M CaCl 2 (steril) 1 ml 5 mg / ml Cholesterin in Ethanol 1 ml 1M MgSO 4 (steril) 25 mL Potassiumphosphate Puffer, pH 6,0 (steril) TB, 1000 ml 12g Bacto Trypton 24 g Hefe-Extrakt 4 mL Glycerol Add 900 ml VE-Wasser Autoclave Nach dem Autoklavieren abkühlen auf 55 ° C und fügen Sie die folgenden Komponenten: 100 ml 0,17 M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 0,6 mM Fluordeoxyuridin (FUDR, sigma cat # F0503), 1000 ml 100 mg FUDR Man löst in 670 ml sterile S-abgeschlossen ist, machen 10 mL oder 45 mL Aliquots. Lagerung bei -20 ° C. 100 mg / mL Carbenicillin, 10 mL 1 g Carbenicillin 10 mL sterilem, deionisiertem Wasser Sterile Filtrat und aliquoten Lagerung bei -20 ° C. Verwenden Sie bei einer Endkonzentration von 50 ug / mL 250ug / mL Amphotericin B, 4 ml 1mg Amphotericin B 4 mL Et-OH Lagerung bei -20 ° C Verwenden Sie bei einer Endkonzentration von 0,1 pg / mL