التسليم المباشر للMorpholinos MIF في Otocyst اسماك الزرد عن طريق الحقن وElectroporation يؤثر على التنمية الداخلية الأذن
概要
وقد تم تطوير طريقة لإيصال morpholinos مباشرة في otocyst الزرد في 24hpf. microinjection به من morpholinos في تجويف الحويصلة الأذنية وelectroporation لإحداث الاختراق ، وكنا قادرين على تجاوز تأثير morpholinos على الدماغ والحصول على آثار محددة على الأذن الداخلية.
Abstract
في السنوات الأخيرة ، أصبح electroporation تقنية الشعبية لترنسفكأيشن في الجسم الحي من الحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي ، وmorpholinos في الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك العين ، والدماغ ، وsomites من الزرد. ميزة electroporation خلال وسائل أخرى للتلاعب الجيني يمكن أن تكون مستهدفة أنسجة معينة ، مكانيا وزمنيا ، لإدخال الجزيئات الكبيرة من تطبيق التيار الكهربائي. نحن هنا وصف استخدام electroporation لtransfecting MIF MIF وmorpholinos تشبه في أنسجة الأذن الداخلية النامية من الزرد. في دراسات سابقة ، MIF morpholino تحقن الأجنة في 1 — 8 خلايا المرحلة أسفرت عن تغيرات شكلية على نطاق واسع في الجهاز العصبي والعين ، وكذلك الأذن. من خلال استهداف أنسجة الأذن الداخلية في مراحل لاحقة في عملية التنمية ، يمكننا تحديد الآثار الأولية لMIF في الأذن الداخلية النامية ، بالمقارنة مع الآثار الثانوية التي قد تنجم عن تأثير الأنسجة الأخرى. باستخدام تويولين phalloidin الأسيتيل وتلطيخ لدراسة مورفولوجية الخلايا العصبية ، والعمليات العصبية ، والخلايا المرتبطة الشعر البقعة الخلفي ، كنا قادرين على تقييم فعالية electroporation كطريقة لترنسفكأيشن المستهدفة في الأذن الداخلية الزرد. تم حقن الحويصلات أذني الأجنة 24hpf مع morpholinos وelectroporated وتمت مقارنة ثم إلى الأجنة التي لم تتلق العلاج أو حقنت فقط أو electroporated. وأظهرت الأجنة التي تم حقنها وelectroporated انخفاض في أعداد خلايا الشعر ، وانخفاض تعصيب من العقدة statoacoustic (SAG) ، وعدد أقل من الخلايا العصبية SAG مقارنة مع مجموعات المراقبة. وأظهرت نتائجنا ان النقل المباشر للmorpholinos في otocysts في مراحل لاحقة يتجنب نظام غير محددة العصبي والآثار العصبية للقمة morpholinos ألقاها في مرحلة الخلية 1-8. أنها تسمح أيضا دراسة التأثيرات التي توجه إلى الأذن الداخلية ، وليس الآثار الثانوية على الأذن من الآثار الأولية في الدماغ ، أو اللحمة المتوسطة قمة العصبية المحيطة بالأذن.
Protocol
Discussion
قدمنا بنجاح المنظمات الأعضاء قليل النوكليوتيد العقاقير في أذن الجنين 24 الزرد HPF. والأجنة التي أثيرت بعد الحقن وelectroporation قابلة للحياة. إذا نجا من أجنة electroporation ، وأنها نمت بمعدلات طبيعية مقارنة الأجنة التي لم تتلق العلاج ، وكذلك الأجنة التي لم تحظ حقن والأجنة التي لم تحظ electroporated.
لاحظنا آثار MIF MIF والمنظمات الأعضاء تشبه الأذن وبعد الحقن عن طريق وضع العلامات electroporation مع phalloidin وتويولين الأسيتيل. Phalloidin تلون شعيرات الأكتين في الخلايا الحسية من الشعر البقعة الخلفية يشير إلى أن من electroporation MIF MIF ومثل MO في المرحلة ال 24 HPF تسبب تغيرات في الخلية الشعر و / أو أرقام أهداب ساكنة عند مقارنة الأجنة التي حقنت فقط مع المنظمات الأعضاء (الشكل 3). هذا الانخفاض في عدد خلايا الشعر ويتسق مع نتائج شين وآخرون (المقدمة) أن المنظمات الأعضاء في MIF MIF وشبيهة تؤدي إلى انخفاض في عدد خلايا الشعر في البقعة الكييس. قد تناقص أعداد الخلايا الشعر في الأجنة التي حقنوا المنظمات الأعضاء وelectroporated تثبت أن electroporation مساعدة في تحريك المنظمات الأعضاء عبر غشاء الخلية ، وبالتالي زيادة حجم التأثيرات المورفولوجية بالمقارنة إلى الأجنة التي تم حقن فقط الحويصلة الأذنية. وقد لوحظت تغييرات في التشكل من خلال تلطيخ العقدة statoacoustic تويولين الأسيتيل. وقد تأثر حجم تعصيب من العقدة statoacoustic ، والأجنة التي تم حقنها وelectroporated تظهر انخفاض المتفرعة من neurites (الشكل 5). قد يكون هناك أيضا انخفاض التكثيف من الخلايا العقدية و / أو انخفاض عدد خلايا العقدة ، وذلك لأن انخفاض كبير في تلطيخ تويولين الأسيتيل في الأجنة التي كانت على حد سواء وحقن electroporated. لأنه قد ثبت لMIF ستكون حاسمة لتطوير النظام العصبي (سوزوكي وآخرون ، 2004) ، قد شهدت تغييرات بعد electroporation يكون نتيجة لزيادة ترنسفكأيشن من MIF MIF والشبيهة. MO حل في الخلايا neuroblast
Electroporation بنسبة ضئيلة من morpholinos العقاقير مباشرة في الأنسجة النامية هو أداة مفيدة للسيطرة على التعبير عن الجينات أثناء تطور الأنسجة ، سواء مكانيا وزمانيا ، في جنين. نتج من Electroporation MIF MIF ومثل المنظمات الأعضاء في أنسجة الأذن الداخلية في التشكل غير طبيعية من البقعة الخلفية على حد سواء ، والعقدة statoacoustic. كان هناك انخفاض في عدد خلايا الشعر الحسية في البقعة الخلفي في الأجنة التي تم حقنها في وelectroporated مقارنة مع الأجنة التي لم يتلق أي علاج ، أو الأجنة التي إما تم حقنه فقط أو electroporated فقط. كان هناك أيضا انخفاض في درجة التعصيب من تصحيح الحسي الخلفي من العقدة statoacoustic وحجم SAG. Electroporation هي طريقة قيمة لtransfecting الجزيئات في أنسجة معينة ، مع الاستفادة من رصد الآثار الأولية لهذا الحمض النووي وجه الخصوص ، RNA ، أو MO في النسيج المطلوب ، وتميز هذه من آثار ثانوية على الأنسجة الأخرى ، بما في ذلك المخ ، والعرف العصبي المحيطة بالأذن اللحمة المتوسطة في التنمية الأذن الداخلية (Barald وكيلي ، 2004).
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة أبحاث الصمم إلى S YC وجبهة الخلاص الوطني في (IOS 0930096) لKFB.
KFB : المعاهد الوطنية للصحة / 2 NINDCD RO1 DC04184 ، 3R01DC004184 – 08W1 NSF ، DBI 0832862 ، 0930096 NSF IOS
Materials
| Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sutter P-97 electrode puller | Equipment | |||
| PV820 Pneumatic PicoPump | Equipment | World Precision Instruments | ||
| M3301L Manual Micromanipulator | Equipment | World Precision Instruments | ||
| Leica S6D stereomicroscope | Equipment | |||
| Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator | Equipment | |||
| Olympus FV500 confocal microscope | Equipment | |||
| 0.01 inch Platinum Wire | Supply | A-M Systems | 711000 | |
| Shrink Tubing | Supply | Newarck Electronics | 03F3172 | |
| Socket Crimp Terminal | Supply | DigiKey | 82PECT-ND | |
| Capillaries | Supply | Stoelting Company | 50613 | |
| Modeling clay | Supply | |||
| Plastic 100 mm Petri dishes | Supply | Falcon | ||
| 6 well plastic plates | Supply | Falcon |
- MOs: 0.3 mM of a combination of for mif, mif-like MO1, and mif-like MO2 was used.
Mif MO is complimentary to the start codon of zebrafish mif mRNA: 5′-acatcggcatgactgcgacagagat-3′. Two MOs were used for mif-like. mif-like MO1 is complimentary to the translational start site: 5′-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3′, while mif-like MO2 derived from AS sequence at the intron1/exon 2 boundary: 5′-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3′. Control MO was the scrambled nucleotide sequence from Gene Tools: 5′-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3′. - methylene blue (0.3 ppm) in fish water
- MS222 (tricaine, Sigma; 0.64 mM in fish water)
- Low-melting point agarose (LMPA; Roche)
- phenol red (Sigma)
- Anti-acetylated tubulin (Sigma)
- Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse second antibody (Molecular probes)
- Texas red-phalloidin (Molecular probes)
参考文献
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).
- Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development. J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).
- Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. From placode to polarization: new tunes in inner ear development. Development. 131, 4119-4135 (2004).
