注射とエレクトロポレーションによりゼブラフィッシュ耳胞イントゥMIFモルフォの直接配信は、内耳の開発に影響を与える

1。エレクトロポレーション用電極の作成適当な長さの75ミクロン径のタングステンワイヤーを（AMシステムズ社Carlsborg、ワシントン州）（約3〜5センチ）カットモレックスケーブルコネクタ（ピンスタンプ真鍮）を介してタングステンワイヤーを置いて下さいワイヤーに縮小チューブを密封するためにタングステンワイヤと収縮チューブ付きモレックスケーブルコネクタ（SPC技術、シカゴ、IL）をラップし、ブンゼンのバーナーやヒートガンで熱を適用するタングステン線の先端をシャープにする、1.0 N水酸化ナトリウムにワイヤーを浸し（コンラッドら、1993）と、他方の電極としてのペーパークリップを使用して、方形波のエレクトロでワイヤーを電解する。我々が使用する条件は、パルス間で50ミリとそれぞれ持続100 msの5ボルトのパルスである。電極には、15〜20ミクロンの直径にシャープされるべきであるエレクトロポレーションに使用する前に粘土に押された溝内のトレイに配線してください 2。エレクトロステーションの設定テープはマイクロマニピュレータ（世界の精密機器）に75μmのタングステン電極を削った。 解剖顕微鏡のステージ（ライカ）の両側に配置マニピュレーター。 プロテクトCUY – 21 [編集]矩形波エレクトロ（図1）に電極を接続してください。 エレクトロの電源を入れ、電圧、パルス持続時間、及びパルス数を含む、エレクトロポレーションのパラメータを、設定します。この実験のための最も効果的なパラメータは、それぞれがそれぞれのパルス間で100ミリ秒で、5.0ms続いたthree 13ボルトのパルスであることがわかった。エレクトロポレーションは、胚中の気泡を作成する場合、パルスの長さを減らす。 3。ゼブラフィッシュ耳胞イントゥモルフォのマイクロインジェクション繁殖タンクから収穫のゼブラフィッシュ胚。で胚をインキュベート胚啓発℃で一晩28.5で0.3 PPMメチレンブルー（ウェスター、2005）で培地を。 サターP – 97電極プラーとガラス針を引っ張る ℃の水浴中で37にアガロースゲル基剤（10mMのペトリ皿に魚の水中の1％アガロース）をウォームアップ溶融までの魚の水の熱を1％低融点アガロース（LMPA）と37℃の水浴中で、冷えないように保管してください。 モルホリノソリューション（GeneTools、コーバリス、OR）とガラスの針を記入し、適切な直径の先端をカット。マイクロマニピュレータ（クーン）に注射針をマウントします。 約10μmの針の先端をカットし、先端がモルホリノソリューションの十分な配信を可能にすることを保証するためにミネラルオイルに注入する。 24時間のpostfertilization（HPF）で胚をDechorinate、0.3 PPMのメチレンブルー魚の水にMS222（tricaine、シグマ）でそれらを麻酔。 便利な均一な分析のための右側面を上にしてアガロースゲルベースの​​上に3〜5麻酔胚の位置を合わせますそれぞれの胚を介して1％LMPAの1〜2滴を入れ、所定の場所に胚を固定するために固めることができます耳胞が右側になるようにペトリ皿を回転させる耳胞の内腔に針を置き、添付の窒素タンク（図2）でPV820空気圧PicoPump（世界の精密機器）とモルホリノソリューションを注入する 4。エレクトロポレーションの手順すぐに注入した後、エレクトロポレーションステーションに取り付けられた胚を移動する耳胞へのちょうど後方組織への正極を置きますが、浸透しない;耳胞にちょうど前脳に負極を挿入するフットペダルを使用するか、スイッチを押すことにより電流を適用する。 アガロースの魚の水を注ぎ、旋回とガラスピペットでアガロースから胚を削除します。胚を傷つけないように、注意してください。除去が困難な胚の場合は、軽く胚を取り巻くあらゆるLMPAを脱却するために針を使用。 場所は、メチレンブルーの魚 ​​の水でプレートの胚および分析のための必要な段階（in situハイブリダイゼーション、etcと微視的anlaysis で 、免疫組織化学的、形態学的）に胚を発生させます。 5。代表的な結果： 図1エレクトロステーション。電極は、シャープ75μmのタングステン線を使用して行われ保護CUY – 21 [編集]矩形波エレクトロにリード線で接続されていました。これらの電極は、マイクロマニピュレータにテープで固定されました。 図2。注入ステーション。すべての胚は、標準化の目的のために右耳に注入した。 図3 3 DPFの胚とアクチンフィラメントのファロイジン染色。 （A）3 DPFの胚injecte制御MOとdは後部黄斑（PM）のファロイジンの強い染色を持っています。 （B）コントロールMOを注入し、エレクトロポレーションされた胚は、注射のみ胚で午後のファロイジン染色の同じようなレベルを持っていた。エレクトロポレーションと一緒にMIF MOの注入は、午後（D）のファロイジン染色の劇的な減少を引き起こした一方（C）単独で耳胞へのMIFのMOとのインジェクションは、ファロイジン染色の低下を引き起こさなかった。 、前黄斑です。 図4 5 DPFの幼虫とアクチンフィラメントのファロイジン染色。標準コントロールモルホリノが（B）に使用されたエレクトロのみインジェクション（）と注入の間に差はなかった。しかし、MIFモルフォとエレクトロポレーションを注入された5 DPFの幼虫は、MIFモルフォ（Cを注入した胚と比べ3 DPFよりもそれほど劇的後黄斑の減少ファロイジン染色（午後）（D）を、、を示した）。 、前黄斑です。 図5 3 DPFにおける胚のアセチル化チューブリン染色。 （A）中の胚は、任意の注射またはエレクトロポレーションを受信しませんでした。 （B）の胚は、エレクトロポレーションがない注射を受信しませんでした。 MIFモルフォと注射とエレクトロポレーション（C、D）の両方を受信する胚は、目に見えて、コントロールと比較してチューブリンの染色を減少していた。 （午後、後部黄斑）。 図6。対照モルホリノ3 DPFにおける胚のアセチル化チューブリン染色。 （A）どんな治療をすることなく胚が後部黄斑（PM）と豊富な神経支配の強力なアセチル化チューブリンの染色を示した。 （B）胚は対照モルホリノを注入。 （C）エンブリオは、エレクトロポレーションで処理した。 （D）制御モルホリノとコントロール胚に注入し、エレクトロポレーションは、治療のコントロールなしに比べて後黄斑と神経支配のアセチル化チューブリンの同じようなレベルがあります。