משלוח ישיר של MIF Morpholinos Into Otocyst דג הזברה על ידי הזרקת electroporation משפיעה על פיתוח האוזן הפנימית
概要
שיטה כדי לספק morpholinos ישירות otocyst דג הזברה ב 24hpf פותחה. שימוש microinjection של morpholinos לתוך לומן של שלפוחית otic ו electroporation אפקט חדירה, הצלחנו לעקוף את ההשפעה של morpholinos על המוח ולקבל השפעות ספציפיות באוזן הפנימית.
Abstract
בשנים האחרונות, electroporation הפך טכניקה פופולרית ב transfection vivo של DNA, RNA, ו morpholinos לתוך רקמות שונות, כולל העין, המוח, somites של דג הזברה. היתרון של electroporation על פני שיטות אחרות של מניפולציה גנטית היא כי רקמות ספציפיות יכול להיות ממוקד, הן במרחב ובזמן, המבוא של מקרומולקולות על ידי יישום של זרם חשמלי. כאן אנו מתארים את השימוש electroporation עבור transfecting MIF ו-MIF כמו morpholinos לתוך הרקמות של האוזן הפנימית בפיתוח של דג הזברה. במחקרים שנעשו בעבר, MIF morpholino מוזרק עוברים על 1 – לשלב 8-cell הביא שינויים מורפולוגיים נרחבת במערכת העצבים העין, כמו גם את האוזן. על ידי מיקוד הרקמות של האוזן הפנימית בשלבים מאוחרים יותר בהתפתחות, אנו יכולים לקבוע את ההשפעות העיקריות של MIF באוזן הפנימית מתפתחות, לעומת השפעות משניות שעלולים לנבוע להשפיע על רקמות אחרות. באמצעות טובולין phalloidin ו acetylated מכתים ללמוד את המורפולוגיה של נוירונים, תהליכים עצביים, ותאי השיער הקשורים המקולה האחורי, היינו מסוגלים להעריך את היעילות של electroporation כשיטה transfection ממוקד באוזן הפנימית דג הזברה. שלפוחית otic עוברים 24hpf הוזרקו morpholinos ו electroporated ו הושוו העוברים כי לא קיבל שום טיפול או היה מוזרק רק או electroporated. עוברים כי הוזרקו ו electroporated נרשמה ירידה במספר התאים שיער, ירידה העצבוב של הגנגליון statoacoustic (SAG) ו נוירונים SAG פחות בהשוואה לקבוצות הבקרה. התוצאות שלנו הראו כי משלוח ישיר של morpholinos לתוך otocysts בשלבים מאוחרים יותר ימנע את המערכת הלא ספציפית העצבים ואת ההשפעות של הרכס העצבי morpholinos נמסר בשלב 1-8 התא. זה גם מאפשר בדיקה של השפעות מכוונות לאוזן הפנימית ולא השפעות משניות על האוזן מפני ההשפעות העיקרית על המוח, רכס עצבי או mesenchyme periotic.
Protocol
Discussion
יש לנו הציג בהצלחה oligonucleotide MOS antisense לתוך האוזן של העובר hpf 24 דג הזברה. עוברים שהועלו לאחר ההזרקה ואת electroporation היו קיימא. אם העוברים שרדו את electroporation, הם גדלו בקצב נורמלי לעומת עוברי כי לא קיבל שום טיפול, כמו גם העוברים שהיו רק מוזרק ועוברים שהיו רק electroporated.
ראינו את ההשפעות של MIF ו-MIF כמו חודש לאחר ההזרקה האוזן electroporation באמצעות תיוג עם phalloidin ו טובולין acetylated. מכתים Phalloidin של סיבי אקטין בתאי השיער חושית של המקולה האחורי עולה כי electroporation של MIF ו-MIF כמו MO בשלב 24-hpf גרמה לשינויים בתא שיער ו / או מספרי stereocilia בהשוואה עוברי כי הוזרקו רק עם MOS (איור 3). ירידה זו במספר התא שיער עולה בקנה אחד עם הממצאים של שן et al. (שהוגשו) כי MOS כדי MIF ו-MIF כמו גרם לירידה במספר התאים שיער המקולה saccular. הירידה במספרים תא שיער עוברי כי הוזרקו MOS ו electroporated להוכיח כי electroporation עשוי לסייע בהעברת MOS על פני קרום התא, ובכך להגדיל את היקף ההשפעה המורפולוגית בהשוואה עוברים בו שלפוחית otic שהוזרק בלבד. שינויים במורפולוגיה של הגנגליון statoacoustic נצפו באמצעות מכתים טובולין acetylated. מידת העצבוב של הגנגליון statoacoustic הושפע, כמו עוברי כי הוזרקו ו electroporated להראות ירידה הסתעפות של neurites (איור 5). כמו כן יכול להיות ירידה התעבות של תאים ganglionic ו / או מספר קטן של תאים הגנגליון, כי מכתים טובולין acetylated היא ירדה משמעותית עוברים כי היו שניהם הזריק electroporated. מכיוון MIF הוכח להיות קריטי להתפתחות מערכת העצבים (סוזוקי et al. 2004), ראו את השינויים לאחר electroporation עשוי להיות תוצאה של transfection מוגברת של MIF ו-MIF כמו פתרון MO לתוך התאים neuroblast.
Electroporation של antisense אוליגו morpholinos ישירות לתוך רקמות מתפתחת הוא כלי שימושי לבקרת ביטוי של גנים במהלך ההתפתחות זה רקמות, הן במרחב ובזמן, בעובר. Electroporation של MIF ו-MIF כמו Mos לתוך הרקמות של האוזן הפנימית הביא מורפולוגיה תקינה של המקולה הן האחורי ואת הגנגליון statoacoustic. היתה ירידה במספר התאים שיער חושית המקולה האחורי בעוברים שהיו מזריקים ו electroporated בהשוואה עוברי כי לא קיבל שום טיפול או עם עוברים אשר גם היה מוזרק רק או electroporated בלבד. הייתה גם ירידה במידת העצבוב התיקון חושית האחורי של הגנגליון statoacoustic וגודל SAG. Electroporation היא שיטה ערך עבור transfecting מקרומולקולות לתוך רקמות ספציפיות, עם יתרון של התבוננות ההשפעות העיקריות של ה-DNA מסוים, RNA, או MO ברקמות הרצוי להפלות בין אלה השפעות משניות על ברקמות אחרות, כולל המוח, ציצה עצביים mesenchyme periotic על התפתחות האוזן הפנימית (Barald וקלי, 2004).
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר לחירשות כדי Yc S ו-NSF (IOS 0930096) כדי KFB.
KFB: NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184, 3R01DC004184-08W1 , NSF DBI 0832862, 0930096 NSF IOS
Materials
| Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sutter P-97 electrode puller | Equipment | |||
| PV820 Pneumatic PicoPump | Equipment | World Precision Instruments | ||
| M3301L Manual Micromanipulator | Equipment | World Precision Instruments | ||
| Leica S6D stereomicroscope | Equipment | |||
| Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator | Equipment | |||
| Olympus FV500 confocal microscope | Equipment | |||
| 0.01 inch Platinum Wire | Supply | A-M Systems | 711000 | |
| Shrink Tubing | Supply | Newarck Electronics | 03F3172 | |
| Socket Crimp Terminal | Supply | DigiKey | 82PECT-ND | |
| Capillaries | Supply | Stoelting Company | 50613 | |
| Modeling clay | Supply | |||
| Plastic 100 mm Petri dishes | Supply | Falcon | ||
| 6 well plastic plates | Supply | Falcon |
- MOs: 0.3 mM of a combination of for mif, mif-like MO1, and mif-like MO2 was used.
Mif MO is complimentary to the start codon of zebrafish mif mRNA: 5′-acatcggcatgactgcgacagagat-3′. Two MOs were used for mif-like. mif-like MO1 is complimentary to the translational start site: 5′-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3′, while mif-like MO2 derived from AS sequence at the intron1/exon 2 boundary: 5′-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3′. Control MO was the scrambled nucleotide sequence from Gene Tools: 5′-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3′. - methylene blue (0.3 ppm) in fish water
- MS222 (tricaine, Sigma; 0.64 mM in fish water)
- Low-melting point agarose (LMPA; Roche)
- phenol red (Sigma)
- Anti-acetylated tubulin (Sigma)
- Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse second antibody (Molecular probes)
- Texas red-phalloidin (Molecular probes)
参考文献
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).
- Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development. J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).
- Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. From placode to polarization: new tunes in inner ear development. Development. 131, 4119-4135 (2004).
