通过注射和电穿孔的斑马鱼Otocyst的MIF Morpholinos直接运抵影响内耳发展

1。为电穿孔电极剪下适当长度的直径为75微米的钨丝（AM系统公司Carlsborg，WA）（约3-5厘米） 将通过电缆莫仕连接器（针加盖黄铜）的钨丝余音钨丝和Molex公司热缩管（SPC技术，芝加哥，IL）和适用于本生灯或热枪热密封萎缩管电线电缆连接器为了加强钨丝尖端，电线浸入1.0 1N氢氧化钠（康拉德等，1993），使用文件夹作为另一个电极，电解线与方波Electroporator的。我们使用的条件是5个50伏的脉冲每期100毫秒和50毫秒脉冲之间。电极应加强以一个直径15-20微米请在一个托盘内的电线，压成泥，在使用前在电的沟槽 2。设置电穿孔站磁带削尖75μm的钨电极micromanipulators（世界精密仪器）。 在解剖显微镜阶段（徕卡）两侧的广场micromanipulators。 连接电极保护CUY – 21编辑方波Electroporator（图1）。 打开electroporator设立电参数，包括电压，脉冲宽度和脉冲数。被发现三个13伏的脉冲持续时间为5.0ms，100ms的每个脉冲之间，这个实验的最有效的参数。如果电在胚胎创建气泡，降低脉冲的长度。 3。 Morpholinos显微注射到斑马鱼奥迪囊泡从养殖池的收获斑马鱼的胚胎。在胚胎胚胎孵育中期提高0.3 PPM的亚甲蓝（韦斯特，2005年）在28.5 ° C过夜。 与萨特的P – 97电极拉马拉玻璃针热身琼脂糖凝胶基地（鱼水的1％琼脂糖凝胶在10毫米培养皿）至37 ° C水浴中烧热1％的低熔点琼脂糖（LMPA）鱼水，直到融化，并保持在37℃水浴保温。 填写与吗啉溶液（GeneTools，科瓦利斯，或）玻璃针和削减适当直径的尖端。装载到一个显微（库恩）的注射针头。 切约10微米的针尖注入矿物油，以确保针尖允许足够吗啉的解决方案交付。 Dechorinate胚胎在受精后24小时（HPF）和麻醉MS222（tricaine，Sigma公司），在0.3 PPM的亚甲蓝鱼水。 琼脂糖凝胶基地，为方便统一的分析与右侧对齐到3至5麻醉胚胎在每个胚胎中放置1至2滴1％LMPA，让固化修复的胚胎旋转的培养皿中，使奥迪囊泡右侧针放入奥迪囊泡腔注入啉的解决方案与PV820气动PicoPump（世界精密仪器），一个附加的氮气罐（图2） 4。电穿孔程序将安装的电车站后，立即注射胚胎放置到组织后的奥迪囊泡的正极，但不穿透;负电极插入大脑前奥迪囊泡应用目前使用脚踏开关或按下一个开关。 琼脂糖倒入鱼水和删除从琼脂糖纷飞和玻璃吸管的胚胎。使用谨慎不破坏胚胎。对于难以去除的胚胎，用针轻轻地打破任何LMPA周围的胚胎。 在一盘与亚甲基蓝鱼水和提高胚胎所需的分析阶段（形态学，免疫组化，原位杂交等和微观anlaysis，）的地点胚胎。 5。代表性的成果： 图1电穿孔站。用削尖的75μm的钨丝电极，通过导线连接到保护CUY – 21编辑方波Electroporator。这些电极贴在micromanipulators。 图2。注水站。所有胚胎注入右耳为达到标准化的目的。 图3。鬼笔环肽染色与3 DPF胚胎微丝。 （一）3 DPF胚胎injecteD与控制莫有强烈的鬼笔环肽染色后的黄斑部（分）。 （二）与对照MO，然后注射电穿孔的胚胎在鬼笔环肽染色时，只注射胚胎相似的水平。 （三）与MIF MOS注入仅奥迪囊泡没有引起减少的鬼笔环肽染色，而随着电MIF MOS注射引起的鬼笔环肽染色时（四）显着减少。上午，前黄斑。 图4。鬼笔环肽染色5 DPF幼虫微丝。没有注射之间的区别只（A）和注射用电击时的标准控制啉（二）。然而，与MIF morpholinos和电穿孔注射5 DPF幼虫呈减少的鬼笔环肽染色后的黄斑部（分）（四），虽然低于3 DPF戏剧性，当与MIF morpholinos（比特彗星注入胚胎相比）。上午，前黄斑。 图5。乙酰化微管蛋白染色胚胎3 DPF。胚胎（一）未收到任何注射或电击。电穿孔（二）的胚胎，但没有收到任何注射。接受注射和电（C，D）与MIF morpholinos的胚胎微管蛋白染色明显减少，与对照组相比。 （时，后黄斑区）。 图6。乙酰化微管蛋白染色胚胎与控制啉DPF 3。 （一）未经任何处理的胚胎表现出较强的乙酰化微管蛋白染色后的黄斑部（分）和广泛的支配。 （二）控制啉注射胚胎。 （三）处理与胚胎电只。 （四）控制与控制啉胚胎注射和电穿孔后黄斑和支配的类似乙酰化微管蛋白的水平相比，没有治疗控制。