Nanoarte de fabricación 1. Nanoarte molienda húmeda de NETZSCH Métodos MicroCer Pesar los cristales de la droga y varios surfactantes que se utilizará para hacer el nanoformulations utilizando una balanza analítica y se mezclan con tampón HEPES 10 mM, pH 7,8 con un T-18 mezclador Ultraturrax hasta su completa dispersión. El porcentaje de la droga en la formulación debe ser entre 1 – 2%. Para la molienda continua, asegúrese de que el refrigerador y el compresor está encendido. La presión de salida debe ser alrededor de 100 PSI antes de comenzar a moler la muestra. Encienda la unidad de control y girar el tanque de molienda para que los medios de molienda puede ser cargado en el tanque. Agregar 50 ml de cuentas a la cámara de molienda con un embudo. Asegúrese de que no hay cuentas en el exterior o en cualquier lugar las discusiones de la cámara de molienda para evitar fugas en el sello mecánico. Asegúrese de que el anillo está en su lugar en la cámara de molienda. Seleccione un tamaño de malla y el uso apropiado del conjunto de la tapa adecuada y segura las tapas de apretar las tuercas. El tamaño de la malla debe ser al menos la mitad del tamaño de los granos. Use un tamaño de malla más grande para evitar que el producto de la obstrucción del filtro, mientras que la molienda continua. Baje la cámara de molienda para que sea horizontal mediante el mando siempre en la parte superior de la cámara y asegúrese de que los envases vacíos de productos de salida del tubo en el recipiente de recolección. Añadir la suspensión de la droga con diversas cantidades de surfactantes para la entrada del producto. El volumen mínimo de la suspensión debe ser de 100 ml. Esto evitará que la cámara de molienda de sobrecalentamiento y también evitar la contaminación del grano debido a un menor desgaste de las piezas Arranque la bomba usando la unidad de control. El caudal se puede variar según sea necesario para su formulación (~ 50 – 150 ml / min). Encienda el agitador y ajustar la velocidad de la unidad de control. La velocidad puede ser incrementada a partir de 620 rpm hasta 4320 rpm en una MicroCer. Controlar la temperatura con el indicador de temperatura que se adjunta en la parte superior de la cámara de molienda y asegúrese de que no hay sobrecalentamiento. Molino de la muestra a diferentes velocidades y velocidades de flujo y sacar pequeñas alícuotas (~ 1 ml) de la formulación de medidas de tamaño y carga con una difracción de dispersión de luz Zetasizer Brookhaven (Tabla 1). Después de que el tamaño deseado, detener la molienda con el mando. Con la bomba sigue en pie, recoger la muestra en un frasco. Deje que el medicamento se drene por completo en el matraz de recogida de muestras. Apagar la bomba. Para eliminar las cuentas, poner una bandeja de recogida debajo de la unidad. Afloje las tuercas de la placa frontal del conjunto de la tapa y recoger las bolas en la bandeja. Retirar la placa frontal y el uso de una botella de agua destilada para lavar los granos en la bandeja. Transferir la suspensión molida en tubos de 50 ml centrífuga y establecer la centrífuga a 10.000 rpm (10.174 FCR) durante 30 minutos. Una vez finalizado el ciclo de centrifugado, medir la cantidad de sobrenadante y reemplazar con la misma cantidad de solución de tensioactivo fresco. Una vez se haya completado la resuspensión, la transferencia de la suspensión a la cámara de molienda y un molino durante 10 minutos. Tomar una alícuota (1 ml ~) y medir el tamaño y la carga de la muestra de nuevo con el Zetasizer (Tabla 1). Realizar una limpieza posterior a la utilización de la MicroCer utilizando agua destilada y etanol al 70%. Medir la concentración de las formulaciones Nanoarte por HPLC. En nuestro caso, hemos evaluado las muestras por HPLC en fase reversa utilizando 20 inyecciones por triplicado l en una columna YMC Octil C8 (Waters Inc., Milford, MA) con un cartucho de C8 guardia. Fase móvil compuesta de 48% de acetonitrilo / 52% 25 mM KH 2 PO 4, pH 4,15 se bombea a 0,4 ml / min con detección de UV / Vis a 272 nm. Para todas las mediciones de drogas, la cuantificación se determina por comparación con una curva estándar de cada fármaco libre (0.025-100 mg / mL) con metanol. 2. Nanoarte homogeneización con el Avestin Emulsiflex C5 Medida de los cristales de la droga y varios surfactantes que se utilizará para hacer el nanoformulations utilizando una balanza analítica y se mezclan con tampón HEPES 10 mM, pH 7,8 con un T-18 mezclador Ultraturrax para obtener una dispersión completa. Transferir la suspensión a la nave de homogeneización y comenzar de recirculación. Asegúrese de que el refrigerador es antes de empezar a homogeneizar la muestra Aumentar la presión poco a poco hasta que la lectura del medidor 20.000 ± 2.000 psi y continúan hasta homogeneizar el tamaño de partícula objetivo se logra. Esto suele tardar entre 45 – 60 minutos. Tomar una alícuota (1 ml ~) periódicamente y medir el tamaño y la carga de la muestra utilizando un Zetasizer (Tabla 1). Transferir la suspensión homogeneizada del homogeneizador de tubos de 50 ml centrífuga y establecer la centrífuga a 10.000 rpm (10.174 FCR) durante 30 minutos. Una vez finalizadoel ciclo de centrifugado, medir la cantidad de sobrenadante y reemplazarlo con un volumen igual de solución de tensioactivo fresco. Después de la resuspensión, la transferencia de la suspensión de la homogeneizador C5. Reiniciar la circulación y devolver la presión de homogeneización a 20.000 ± 2.000 psi y homogeneizar durante 30 minutos. Medir el tamaño y la carga de la formulación con el Zetasizer (Tabla 1). Realizar la limpieza posterior de la unidad con agua destilada y etanol como disolvente. Medir la concentración de las muestras mediante HPLC. 3. Sonicación utilizando el procesador de Cole Parmer Ultrasonic Medir 50 ml de diclorometano en un vaso de vidrio. Medida 6 g de poli (láctico-co-glicólico) (PLGA), utilizando la balanza analítica, se suman a la de diclorometano y mezclar hasta su completa disolución que se observa. Medida de 1,25 g de los cristales de la droga y añadir a la diclorometano / solución de PLGA. Mezcle hasta obtener la disolución completa. Hacer 1% de alcohol polivinílico (PVA) solución de tensioactivo y enfriar con un baño de hielo. Asegúrese de que la solución de tensioactivo se enfríe antes de la adición de la solución orgánica que contiene el fármaco disuelto. Vierta la solución de la droga en la solución de tensioactivo de 1% PVA e iniciar el ultrasonicador el 50% de la amplitud. Asegúrese de que la solución de surfactante se coloca en un baño de hielo. La amplitud de la sonicador se puede reducir a la amplitud de ~ 30% para los pequeños lotes de muestras. Sonicar la muestra durante 10 minutos. Saca una pequeña alícuota (~ 1 ml) para el análisis del tamaño de partícula (Tabla 1). Si el tamaño de las partículas es mayor de 1,5 micras, sonicar la muestra a intervalos de 2 minutos, hasta un máximo de 16 minutos en total. Observar las muestras en el microscopio a 20x y las observaciones del documento (Figura 1). Use una placa de agitación para crear un vórtice adecuado para el resto de la suspensión y continuar mezclando durante la noche a temperatura ambiente. Pesan 8 g de manitol en un matraz y agregar 80 ml de agua RO. Mezclar hasta disolución completa se observa y se almacenan a temperatura ambiente. Esto se utiliza para la resuspensión tras la centrifugación si las muestras deben ser liofilizada. Recoger la suspensión después de 24 horas y se vierte en tubos de 50 ml centrífuga. Centrifugar las muestras a una velocidad de 8.000 rpm durante 20 minutos a 5 ° C. Se decanta el sobrenadante y resuspender la mitad de la muestra en 75 ml de filtrado por ósmosis inversa (RO) y la otra mitad en 75 ml de bromuro de cetil trimetilamonio 0,5% (CTAB) surfactante. Centrifugar las muestras una vez más a una velocidad de 8.000 rpm durante 20 minutos a 5 ° C y resuspender cada una de las pastillas con un total de 20 ml de solución de manitol. Después de la resuspensión en segundo lugar, medir el tamaño de las partículas con el Zetasizer (Tabla 1). Utilizar los viales adecuado para transferir el resto de la suspensión y los situará en el liofilizador. Medir la concentración de las muestras mediante HPLC. 4. Nanoarte Morfología Tome la suspensión de Nanoarte y brevemente ultrasonidos en un 20% de la amplitud durante 5 segundos con una sonda de ultrasonidos. Transferencia de 10 l de la suspensión en 1,5 ml de agua de ósmosis inversa dentro de un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml y agitar durante 10 segundos. Tomar una muestra de 50 l de la solución de agua-Nanoarte y transferir a un aparato de filtración que consiste en un soporte de polipropileno de 13 Swinnex filtro montado con una membrana de filtración 0,2 micras de policarbonato (Nuclepore pista grabado). El aparato de filtración se prepara con 50 0.2μm l de agua filtrada destilada antes de la adición de la suspensión de la droga diluida. Vacío se aplica al aparato hasta que el volumen de la solución completa ha sido completamente extraída más allá de la filtración por membrana. Una vez que la membrana se seca, se fija a un talón de pasador de aluminio con cinta adhesiva de doble vara conductora de carbono y por pulverización catódica recubierto con paladio. El talón de muestra se utilizando imágenes, en nuestro caso, un JEOL JSM6300F de baja tensión, de emisión de campo microscopio electrónico de barrido (Figura 2). 5. Nanoarte visualización Tome las suspensiones Nanoarte preparado y ultrasonidos por 10 segundos a 20% de la amplitud con una sonda de ultrasonidos. Tener una cubierta de portaobjetos de microscopio de deslizamiento y colocarlo en un microscopio invertido. En la hoja de la cubierta de mezcla 15 ul de la suspensión Nanoarte con 100 l de tampón fosfato salino (PBS) y se mezcla con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces. Visualizar las nanopartículas utilizando un objetivo de 20x (Figura 3). Biología de Nanoarte 6. El aislamiento y la preparación de transmisión sanguínea y macrófagos monocitos derivados de los monocitos (MDM) Obtener los monocitos humanos por aféresis de VIH-1 y los donantes seronegativos hepatitis y purificar las células por decantación a contra corriente centrífuga. Evaluar la pureza de células por inmunomarcación con anti-CD68 (clon KP-1) De Wright-manchada cytospins 1. Monocitos Cultura purificada en DMEM suplementado con 10% inactivado por calor combinado de suero humano, el 1% de glutamina, 50 mg / ml de gentamicina, 10 mg / ml de ciprofloxacino y 1000 U / mL factor recombinante humano estimulante de colonias de macrófagos (MCSF) a una concentración de 1×10 6 células / ml a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO 2. Placa de 2×10 6 células por pocillo en placas de 6 pocillos y células en cultivo durante 7 días a fin de que los monocitos se diferencian en macrófagos a 1. (Figura 3) 7. Células de captación y recolección Mix Nanoarte con medios de cultivo (sin MCSF) a una concentración final de 100 mM y agregar 1 ml de medio de tratamiento a cada pocillo. En el punto deseado de tiempo, o cuando las baterías están completamente cargadas con Nanoarte (Figura 2), eliminar todos los medio de tratamiento y lavado de las células 3 veces con 1 ml de PBS para eliminar cualquier partícula que no han sido tomadas por las células. En 1 ml de PBS, eliminar las células adherentes desde el fondo del pozo mediante el uso de un levantador de la célula y colocarlas en un tubo de 1,7 mL microcentrífuga de 2-4. Centrifugar las células a 1000 fcr a 4 ° C durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante y agregar 200 uL de metanol al 100%. Lisis de las células y disolver Nanoarte brevemente (2-5 segundos) sonicando la pastilla con una sonda de ultrasonidos en un 20% de la amplitud. Almacene las muestras en -80 ° C hasta el momento de analizar el contenido de drogas. 8. La retención intracelular de Nanoarte Tratar MDM como se describe en 7.1. En el punto de tiempo deseado, lavar las células como se describe en 7.2, pero en vez de inmediatamente raspando las células, fijar las células durante 15 min a temperatura ambiente en una solución de glutaraldehído al 3% en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) y además fijar por 10 minutos con tetróxido de osmio al 1% en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4). Retire el fijador y raspar las células en 1 ml de PBS como se describe en el apartado 7.2. También, recoger y centrifugar las células como se describe en el apartado 7.2, pero en lugar de añadir metanol a la bolita, añadir 200 l de la solución fijadora de glutaraldehído. Cortar en finas sedimento celular (80 nm) secciones con un micrótomo. Tinción de las secciones con acetato de uranilo y citrato de plomo. Observe las secciones teñidas mediante microscopía electrónica de transmisión (Figura 4). 9. ART lanzamiento Tratamiento de las células como se describe en 7.1-7.2, sin embargo, en lugar de recoger las células después del lavado, sustituya PBS con 2 ml de medio de cultivo celular sin MCSF y sin Nanoarte. En los días indicados, o según lo indicado por medio de cultivo celular de inflexión medio amarillo, cambio del medio. En el día deseado, recoger 1 ml de medio celular junto con las células se replican como se describe en 7.2-7.3. Las células de proceso como se describe en 7.3. Proceso de mediano mediante la adición de 150 ml de muestra de medio a 1 ml de metanol al 100% y agitar a toda velocidad durante 10 segundos. Centrifugar las muestras a 21.000 rcf durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante y transferirlo a un tubo nuevo. Se evapora el metanol con una centrífuga de vacío, lo cual puede tomar de 1 a 4 horas dependiendo de la muestra. Almacene las muestras en -80 ° C hasta que esté listo para el análisis de drogas. 10. En tiempo real de captación de Nanoarte por microscopía confocal Tome MDM maduras desde el paso 6.2 y la etiqueta de las células utilizando una solución de etiquetado de células, como la solución de etiquetado Vybrant celular siguiendo las instrucciones del fabricante. Enjuague las células 3 veces con 1 ml de medio de cultivo para eliminar el exceso de tinte. Mix Nanoarte con medio de cultivo como en el paso 7.1 utilizando Nanoarte marcados con fluorescencia. Añadir medio de tratamiento con Nanoarte etiquetados inmediatamente antes de la imagen con un microscopio confocal. Capturar una imagen cada 30 segundos durante 4 horas con un objetivo de 60x 5 (Videos 1 y 2). Infección VIH-1 y los ensayos de infectividad 11. VIH-1 ADA infección Tratamiento de las células como se describe en 9.1-9.3. En los días que desee, eliminar todas las medianas y reemplazar con el medio, sin MCSF, que contiene el VIH-1 de la ADA en una multiplicidad de infección de 0,01 partículas virales / célula y se incuba durante 24 horas 1. Quitar medio viral y reemplazar con agua fresca y libre de virus medios de comunicación. Células en cultivo durante 10 días el intercambio de la mitad de la media cada dos días o según sea necesario para mantener las células vivas (Figura 5) 6. Diez días después de la infección reunir 10 l de medio de cada pocillo, en lugar de una placa de 96 pocillos, y se almacena a -80 ° C hasta que esté listo para realizar retroviral (hacia atrás) el análisis de la transcriptasa inversa. 12. De la transcriptasa inversa (RT) Ensayo Con cada muestra de 10 l en el paso 11.3, mezcla de 10 l de una solución que contiene 100 mM Tris-HCl (pH 7,9), 300 mM KCl, 10 mM DTT, 0,1% nonil phenoxylpolyethoxylethanol-40 (NP-40), y el agua. Incubar la mezcla durante 15 minutos a 37 ° C 7. <l i> A continuación, añada 25 L de una solución que contiene 50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 150 mM KCl, 5 mM DTT, 15 mM MgCl 2, 0,05% NP-40, 10 mg / ml de poli (A), 0.250 U / mL oligo d (T) 12-18, y 10 Ci / mL 3 H-TTP en cada pocillo y se incuba a 37 ° C durante 18 horas 7. Después de la incubación, se añaden 50 l de helado de 10% de ácido tricloroacético (TCA) a cada pocillo. Cosecha de los pozos en filtros de fibra de vidrio, y evaluar los filtros de 3 H-TTP incorporación de β-espectroscopia de centelleo de 7. 13. VIH-1p24 Detecciones Lavar las células se replican desde que fue retirado de la muestra retroviral transcriptasa medio en el paso 11.3 por lavado con 1 ml de PBS 3 veces. Fijar las células con paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ° C. A la mañana siguiente lavar las células tres veces con PBS. El uso de anticuerpos monoclonales de ratón contra el VIH-1 p24 (1:10, Dako, Carpinteria, CA) para visualizar la infección por VIH. Las celdas de imagen en campo claro con un objetivo de 40x (Figura 6). 14. Los resultados representativos: Droga Tamaño (Nm) PDI Cargo (Mv) Surfactantes IDV 1052 0.286 -24.58 P188 0,5%, 5,0% SDS, sacarosa 9,25% RTV 233 0.273 -7,47 P188 0,5%, 9,25% de sacarosa ATZ 840 0.192 25.47 P188 0,5%, 0,1% mPEG 2000-DSPE, un 1,0% DOTAP, 9,25% de sacarosa EFV 347 0.235 -13.52 1,0% PVA Tabla 1. Características físicas de Nanoarte Tabla muestra los posibles valores representativos de las características físicas de las formulaciones Nanoarte fabricado con los agentes tensioactivos indicados. Los valores incluyen el diámetro medio basado en la intensidad de la luz dispersada, el índice de polidispersidad (PDI, una estimación de la distribución de tamaño de partículas), y los valores de potencial zeta obtenidos en muestras de nanoformulation diferentes. Abreviaturas utilizadas en la tabla: IDV: indinavir, RTV: ritonavir, ATV: atazanavir, EFV: effavirenz; PVA: alcohol polivinílico, de sodio SDS dodecil sulfato; P188: poloxámero 188 (también llamado Pluronic F68), MPEG-2000 DSPE: metil-poli (etileno-glicol) 1,2-distearoil-fosfatidil-etanolamina; DOTAP: (1-oleoil-2-[6 – [(7-nitro-2-1 ,3-benzoxadiazol-4-il) amino] hexanoilo] – 3-trimetilamonio propano. FIGURA 1. Diagrama de flujo que resume los diversos métodos utilizados para la fabricación de Nanoarte. La Figura 1 resume los diversos métodos utilizados para la fabricación de Nanoarte. El diagrama de flujo incluye una previsión de tiempo de asignación para cada una de las fases críticas de los métodos respectivos. Figura 2. Imágenes representativas de la morfología Nanoarte deseables y no deseables. Análisis de microscopía electrónica de exploración (ampliación, 15.000 X) de RTV Nanoarte producido por homogeneización, molienda húmeda, y ultrasonidos en la parte superior de una membrana de filtración de 0,2 micras de policarbonato. Barra de medida es igual a 2,0 m en todos los marcos. Nanoarte deseable consisten, en promedio, de los pequeños (≤ 2 m) auto-contenido de partículas con bordes lisos que tienden a tener la misma forma o similar. Nanoarte indeseables varían mucho en tamaño y forma y se pueden fusionar y / o peguen unos a otros. Figura 3. Imágenes de la solución de Nanoarte deseable y de MDM tomando Nanoarte. Brillantes imágenes de microscopía de campo (todos adquiridos utilizando un objetivo de 20x) de homogeneizado RTV-NP y MDM tomando Nanoarte. Después de combinar 10 L de RTV-NP solución con 100 l de PBS en la parte superior de una hoja de cubierta de vidrio, las partículas son visibles y se asemejan a la arena con sólo unas pocas de las partículas más grandes individualmente identificable (A). Imagen de totalmente diferenciada y MDM en forma de huso antes Nanoarte tratamiento (B). Después que las células han tomado Nanoarte, se vuelven más oscuras y sus núcleos se hacen más evidentes debido a la distribución de Nanoarte perinuclear, sin embargo, siguen manteniendo su cuerpo en forma de células fusiformes (C). Una vez que las células se sobrecargan con Nanoarte, los núcleos se oscureció, y las células se redondean, la pérdida de su estructura en forma de huso y, potencialmente, se desprenden del fondo del pozo (D). 4 "/> FIGURA 4. Confirmación de la incorporación celular de Nanoarte en MDM. Microscopía electrónica de transmisión (ampliación, 15.000 x) muestra absorción de Nanoarte en MDM expuestos a RTV-NP de homogeneización (A), RTV-NP de la molienda húmeda (B), RTV-NP de ultrasonidos (C), y las células no tratadas (D ). Dentro de las células, el Nanoarte deben ser fácilmente identificables por su forma geométrica. Tenga en cuenta la falta de estructuras geométricas evidentes en la celda de control (D). Un ejemplo de cada partícula se ha esbozado: rojo para la homogeneización (A), azul para la molienda húmeda (B), verde para el tratamiento con ultrasonidos (C). Estructura de las partículas debe ser similar a lo que se había visto con SEM. Barra de medida es igual a 5.0 m en todos los marcos. Figura 5. Diagrama del método para probar la eficacia antirretroviral de Nanoarte. Con el fin de comprobar la capacidad de Nanoarte para inhibir la replicación viral MDM deben ser tratados primero con Nanoarte y luego se exponen al VIH-1 ADA. Similar a los estudios ART liberación, MDM se cargan con Nanoarte y luego se lavan para eliminar cualquier partícula que no han sido internalizados. Nanoarte laden MDM luego se cultivaron hasta 15 días con un intercambio de soportes de media cada dos días. Durante este tiempo (por lo general en los días 1, 5, 10 y 15) MDM se enfrentan al reto del VIH-1 ADA. Después de cada exposición al virus las células son cultivadas por otros 10 días con el fin de permitir que la infección avance. El día 10 después de la infección se recogen muestras de los medios de comunicación para el análisis de RT y células fijadas y teñidas para el antígeno p24. No Nanoarte MDM tratados, infectadas y no infectadas, también se cultiva en paralelo y la prueba de la presencia del antígeno p24 y la actividad RT. FIGURA 6. Prueba de la eficacia Nanoarte del VIH-1 MDM infectados por la tinción de p24. Imágenes brillantes de campo (20x objetivo) de RTV-NP tratados MDM 10 días después de ser cuestionado por el VIH-1 ADA. No hay infección estaba presente cuando las células se estimularon con virus1 días post-tratamiento Nanoarte (A); nota la presencia de NP en el citoplasma de la mayoría de las células (A recuadro indicado por las flechas). La infección estaba presente cuando las células fueron expuestas al virus 10 días después del tratamiento Nanoarte (B), aunque mucho menos que las células no tratadas con Nanoarte (D); nota la presencia sostenida de NP en algunas células (en el recuadro B indicado por las flechas), pero menos que en el día 1 post-tratamiento Nanoarte (A recuadro). Imagen de las células que fueron tratadas ni con Nanoarte ni infectado (C), la falta nota de NP en el citoplasma celular (C recuadro). Imagen de las células que no fueron tratados con Nanoarte pero expuestos al VIH-1 ADA (D). VIDEO 1. Confocal en vivo microscopia de células de los pobres de RTV-NP absorción por MDM. Microscopía de fluorescencia de las MDM etiqueta verde con Vybrant DiO células etiquetado solución y se trata con rojo marcado con RTV-NP. Una imagen fue tomada cada 30 segundos durante 4 horas con un aumento de 60x. Haga clic aquí para ver el video VIDEO 2. Confocal en vivo microscopia de células de éxito RTV-NP absorción por MDM. Microscopía de fluorescencia de las MDM etiqueta verde con Vybrant DiO células etiquetado solución y se trata con rojo marcado con RTV-NP. Una imagen fue tomada cada 30 segundos durante 4 horas con un aumento de 60x. Haga clic aquí para ver el video
