NanoART fabricação 1. NanoART moagem úmida por NETZSCH MicroCer Métodos Pesar os cristais de drogas e vários surfactantes que será usado para fazer a nanoformulations em uma balança analítica e misturá-los com 10 tampão Hepes mM, pH 7,8 usando um T-18 misturador Ultraturrax até que esteja completamente dispersas. Por cento da droga na formulação deve estar entre 1-2%. Para a moagem contínua, certifique-se que o chiller eo compressor está ligado. A pressão de saída deve ser em torno de 100 PSI antes de começar a fábrica de sua amostra. Ligue a unidade de controle e gire o tanque de moagem de modo que o meio de moagem pode ser carregado no tanque. Adicionar 50 mL de contas à câmara de moagem através de um funil. Certifique-se que não há contas no exterior ou em qualquer lugar tópicos da câmara de moagem para evitar vazamentos no selo mecânico. Certifique-se que o O-ring está em seu lugar na câmara de moagem. Selecione uma malhagem adequada tela e usar o conjunto da tampa adequada e segura as pálpebras apertando as porcas. O tamanho da malha da tela deve ser de pelo menos metade do tamanho dos grânulos. Use um tamanho de malha de tela grande para evitar o entupimento do filtro, enquanto moagem contínua. Inferior da câmara de moagem para torná-la horizontal utilizando o botão fornecidas no topo da câmara e certifique-se que o produto esvazia tomada tubo no recipiente de recolha. Adicionar a suspensão de drogas com diferentes quantidades de surfactantes para a entrada do produto. O volume mínimo de suspensão deve ser de 100 mL. Isso vai impedir a câmara de moagem de superaquecimento e também evitar a contaminação do grânulo devido ao menor desgaste das peças Ligue a bomba usando a unidade de controle. A vazão pode ser variado, conforme exigido para a sua formulação (~ 50-150 mL / min). Ligue o agitador e ajustar a velocidade na unidade de controlo. A velocidade pode ser aumentada de 620 rpm a 4320 rpm em um MicroCer. Monitorar a temperatura usando o medidor de temperatura que é anexado no topo da câmara de moagem e certifique-se que não há superaquecimento. Moinho da amostra em várias velocidades e taxas de fluxo e retirar pequenas alíquotas (~ 1 mL) da formulação de tamanho e carga medições usando um difração da luz Scattering Brookhaven Zetasizer (Tabela 1). Depois que o tamanho desejado é obtido, parar a moagem usando a unidade de controle. Com a bomba ainda sobre, coletar a amostra para um balão. Permitem que a droga completamente drenam para o frasco de coleta da amostra. Desligue a bomba. Para remover as contas, coloque uma bandeja de coleta sob a unidade. Solte as porcas na placa frontal do conjunto da tampa e recolher as contas na bandeja. Retire a placa da frente e use uma garrafa de água deionizada para lavar as contas na bandeja. Transferir a suspensão moída em 50 tubos de centrífuga mL e definir a centrífuga a 10.000 rpm (10,174 rcf) por 30 minutos. Após a conclusão do ciclo de centrifugação, medir a quantidade de sobrenadante e substituir com a mesma quantidade de solução de surfactante fresco. Uma vez que a ressuspensão está completa, transferir a suspensão para a câmara de moagem e fábrica para 10 minutos. Tomar uma alíquota (~ 1 mL) e medir o tamanho e carga da amostra novamente usando o Zetasizer (Tabela 1). Faça uma limpeza pós-uso do MicroCer utilizando água deionizada e etanol 70%. Medir a concentração das formulações nanoART usando HPLC. No nosso caso, avaliamos as amostras por HPLC de fase reversa usando injeções de 20 mL triplicado em uma coluna C8 YMC Octyl (Waters Inc., Milford, MA) com um guarda C8 cartucho. Fase móvel composta de acetonitrila 48% / 52% 25mM KH 2 PO 4, pH 4,15 é bombeado em 0,4 mL / min com detecção UV / Vis em 272 nm. Para todas as medições de drogas, a quantificação é determinado pela comparação com uma curva padrão de cada droga livre (,025-100 mcg / mL), preparada em metanol. 2. NanoART Homogeneização usando o Avestin EmulsiFlex C5 Medida que os cristais de drogas e vários surfactantes que será usado para fazer a nanoformulations em uma balança analítica e misturá-los com 10 tampão Hepes mM, pH 7,8 usando um T-18 misturador Ultraturrax para obter completa dispersão. Transferir a suspensão para o navio de homogeneização e começar a recirculação. Certifique-se que o chiller está em antes de começar a homogeneizar a amostra Aumentar gradualmente a pressão até o medidor lê 20.000 ± 2.000 psi e continuar até a homogeneizar o tamanho das partículas alvo seja alcançado. Isso geralmente leva entre 45-60 minutos. Tomar uma alíquota (~ 1ml) periodicamente e medir o tamanho e carga da amostra, utilizando um Zetasizer (Tabela 1). Transferir a suspensão homogeneizada do homogeneizador para 50 tubos de centrífuga mL e definir a centrífuga a 10.000 rpm (10,174 rcf) por 30 minutos. Após a conclusão dao ciclo de centrifugação, medir a quantidade de sobrenadante e substituir com um volume igual de solução de surfactante fresco. Após a ressuspensão, transferir a suspensão para o homogeneizador C5. Reiniciar a circulação e retorno a pressão de homogeneização a 20.000 ± 2.000 psi e homogeneizar por 30 minutos. Medir o tamanho e carga da formulação usando o Zetasizer (Tabela 1). Realizar a limpeza pós da unidade com água deionizada e etanol como solvente. Medir a concentração das amostras utilizando HPLC. 3. Sonicação utilizando o processador Cole Parmer Ultrasonic Medir 50 mL de diclorometano em um copo de vidro. G Medida 6 de poli (láctico-co-glicólico ácido) (PLGA), utilizando a balança analítica, adicionar ao diclorometano, e misturar até a completa dissolução é observado. Medida 1,25 g de cristais de drogas e adicionar ao diclorometano / solução PLGA. Mistura para obter a dissolução completa. Fazer 1% de álcool polivinílico solução surfactante (PVA) e resfriá-lo usando um banho de gelo. Certifique-se que a solução surfactante é legal antes da adição da solução orgânica que contém a droga dissolvida. Despeje a solução de drogas na solução 1% surfactante PVA e iniciar o ultrasonicator na amplitude de 50%. Certifique-se que a solução surfactante é colocado em um banho de gelo. A amplitude do sonicador pode ser reduzido a amplitude ~ 30% para lotes menores de amostras. Sonicate a amostra por 10 minutos. Retire uma alíquota pequena (~ 1 mL) para análise granulométrica (Tabela 1). Se o tamanho das partículas é superior a 1,5 mM, sonicate a amostra em intervalos de 2 minutos até um máximo de 16 minutos no total. Observe as amostras ao microscópio em 20x e observações documento (Figura 1A). Use uma placa de agitá-lo para criar um vórtice adequado para a suspensão restantes e continue misturando durante a noite a temperatura ambiente. Pesar 8 g de manitol para um balão de água e adicionar 80 mL RO. Misturar até a completa dissolução é observado e armazenar em temperatura ambiente. Este será utilizado para a ressuspensão após a centrifugação se as amostras precisam ser liofilizado. Recolher a suspensão após 24 horas e despeje em 50 tubos de centrífuga mL. Centrifugar as amostras a uma velocidade de 8.000 rpm por 20 minutos a 5 ° C. Decantar o sobrenadante e ressuspender uma metade da amostra em 75 mL de osmose reversa filtrada (RO) de água ea outra metade em 75 mL de brometo trimetilamônio 0,5% cetílico (CTAB) surfactante. Centrifugar as amostras novamente a uma velocidade de 8.000 rpm por 20 minutos a 5 ° C e ressuspender cada uma das pelotas com um total de 20 ml de solução de manitol. Após a ressuspensão em segundo lugar, medir o tamanho das partículas usando o Zetasizer (Tabela 1). Use frascos adequados para transferir a suspensão restantes e colocá-los no liofilizador. Medir a concentração das amostras utilizando HPLC. 4. Morfologia NanoART Tome suspensão nanoART e brevemente sonicate em amplitude de 20% por 5 segundos com uma sonda de sonicação. Transfira 10 mL da suspensão em 1,5 mL de água RO dentro de um tubo de microcentrífuga 1,7 mL e vortex por 10 segundos. Tomar uma amostra de 50 mL da solução de água nanoART-e transferir para um aparelho de filtração que consiste em um suporte de polipropileno Swinnex 13 filtro montado com um 0,2 mM filtração por membranas de policarbonato (Nuclepore Track-gravado). O aparelho de filtração está preparado com 50 mL 0,2 Hm água destilada filtrada antes da adição da suspensão da droga diluída. Vácuo é então aplicado ao aparelho até que o volume solução inteira foi completamente puxado passado a membrana de filtração. Uma vez que a membrana é seca, é afixada a um esboço sobre pinos de alumínio com dupla pau de fita de carbono condutora e sputter revestidas com paládio. O stub amostra é então fotografada usando, no nosso caso, um JEOL JSM6300F de baixa tensão, de emissão de campo microscópio eletrônico de varredura (Figura 2). 5. Visualization NanoART Tomar as suspensões nanoART preparado e sonicate-los por 10 segundos a amplitude de 20% com uma sonda de sonicação. Dê uma tampa deslizante microscópio escorregar e colocá-lo em um microscópio invertido. Na lamínula mix 15 mL da suspensão nanoART com 100 L de tampão fosfato salino (PBS) e misturar por pipetagem cima e para baixo várias vezes. Visualize as nanopartículas utilizando objetiva de 20x (Figura 3). Biologia da nanoART 6. Isolamento e preparação de sangue Borne monócitos macrófagos e monócitos derivados (MDM) Obtenção de monócitos humanos por leucaférese de HIV-1 e doadores soronegativos hepatite e purificar as células por contra-corrente elutriação centrífuga. Avaliar a pureza da célula por imunomarcação com anti-CD68 (clone KP-1) De Wright-manchada cytospins 1. Monócitos cultura purificada em DMEM suplementado com inativado pelo calor de 10% em pool de soro humano, 1% de glutamina, 50 mcg / ml de gentamicina, 10 mcg / mL ciprofloxacina e 1000 U / mL fator de colônia de macrófagos recombinante humano estimulante (MCSF) a uma concentração de 1×10 6 células / mL a 37 ° C em atmosfera húmida com 5% de CO 2. Placa de 2×10 6 células por poço em placas de 6-bem e células de cultura por 7 dias, a fim de permitir que os monócitos se diferenciar em macrófagos 1. (Figura 3A) 7. Captação e Coleta de célula Mix nanoART com meios de cultura (sem MCSF) para uma concentração final de 100 mM e adicionar 1 mL de meio de tratamento a cada poço. No ponto desejado do tempo, ou quando as células são totalmente carregado com nanoART (Figura 2), remova todos os meio de tratamento e lavar as células 3 vezes com 1 mL de PBS para remover quaisquer partículas que não tenham sido tomadas pelas células. Em 1 mL de PBS, remove células aderentes do fundo do poço usando um levantador celular e colocá-los em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL 2-4. Centrifugar as células a 1000 rcf a 4 ° C por 10 minutos. Remover o sobrenadante e adicionar 200 mL de metanol 100%. Lisar as células e dissolve nanoART por breves (2-5 segundos) sonicando a pelota com uma sonda sonicando na amplitude de 20%. Armazene as amostras em -80 ° C até que esteja pronto para analisar o conteúdo de drogas. 8. Retenção intracelular de NanoART Tratar MDM, conforme descrito em 7.1. No ponto de tempo desejado, lave as células, como descrito no item 7.2, mas em vez de imediatamente raspar as células, corrigir as células por 15 min em temperatura ambiente em uma solução de glutaraldeído 3% em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) e ainda corrigi-los para 10 minutos com tetróxido de ósmio 1% em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4). Remover fixador e raspar as células em 1 mL de PBS, conforme descrito em 7.2. Também, recolher e centrifugar células como descrever em 7,2, mas em vez de adicionar metanol para o sedimento, adicionar 200 mL da solução fixadora de glutaraldeído. Corte pellet celular em finos (80 nm) seções com um micrótomo. Mancha as seções com acetato de uranila e citrato de chumbo. Observe cortes corados por microscopia eletrônica de transmissão (Figura 4). 9. Lançamento ART Tratar células, conforme descrito no 7,1-7,2, no entanto, em vez de coletar células após a lavagem, substitua PBS com 2 mL meio de cultura de células sem MCSF e sem nanoART. Nos dias indicados, ou como indicado por meio de cultura celular virar meia troca amarelo, do meio. No dia desejado, recolher 1 mL do meio celular, juntamente com as células replicam como descrito no 7,2-7,3. Células de processo, conforme descrito em 7.3. Meio do processo, adicionando 150 mL de amostra de médio a 1 mL de metanol 100% e vortex a toda a velocidade por 10 segundos. Em seguida, centrifugar as amostras em 21.000 rcf por 10 minutos. Remover o sobrenadante e transferir para um novo tubo. Evaporar o metanol com uma centrífuga a vácuo, o que pode levar de 1 a 4 horas, dependendo da amostra. Armazene as amostras em -80 ° C até que esteja pronto para análise de drogas. 10. Em tempo real de Captação de NanoART por microscopia confocal Tome MDM maduros a partir do passo 6.2 e rotular as células usando uma solução de etiquetagem de células, tais como Solução Vybrant celular Labeling seguir as instruções do fabricante. Lavar as células 3 vezes com 1 mL de meio de cultura para remover qualquer excesso de corante. Mix nanoART com meio de cultura como no passo 7,1 utilizando nanoART fluorescente etiquetado. Adicionar meio de tratamento com nanoART rotulados imediatamente anterior ao de imagem com um microscópio confocal. Capturar uma imagem a cada 30 segundos por 4 horas utilizando objetiva 60x 5 (Vídeos 1 e 2). Infecção HIV-1 e Ensaios Infectividade 11. HIV-1 ADA Infecção Tratar células, conforme descrito no 9,1-9,3. Nos dias desejado, remova todas as médias e substituir com o meio, sem MCSF, contendo HIV-1 ADA em uma multiplicidade de infecção de 0,01 partículas virais / célula e incubar por 24 horas 1. Remova o meio viral e substituir por novas, sem vírus de mídia. Células de cultura por 10 dias a troca de um meia de médio a cada dois dias ou conforme necessário para manter as células vivas (Figura 5) 6. Dez dias após a infecção coletar 10 mL do meio de cada bem, coloque em uma placa de 96 poços, e armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para executar a análise transcriptase retroviral (reverso). 12. Transcriptase reversa Assay (RT) Com cada amostra de 10 mL a partir do passo 11.3, mistura de 10 L de uma solução que contém 100 mM Tris-HCl (pH 7,9), 300 mM KCl, 10 mM DTT, 0,1% de água nonil phenoxylpolyethoxylethanol-40 (NP-40), e. Incubar a mistura por 15 minutos a 37 ° C 7. <l i> Em seguida, adicione 25 mL de uma solução que contém 50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 150 mM KCl, 5 mM DTT, 15 mM MgCl 2, 0,05% NP-40, 10 mcg / mL poli (A), 0,250 U / mL oligo d (T) 18/12, e 10 μCi / mL 3 H-TTP a cada poço e incubar a 37 ° C por 18 horas 7. Após a incubação, adicionar 50 mL de ácido gelada 10% tricloroacético (TCA) a cada poço. Colheita dos poços em filtros de fibra de vidro, e avaliar os filtros para incorporação de 3 H-TTP pela cintilação β-espectroscopia 7. 13. HIV-1p24 Detecções Lave as células replicar a partir do qual amostra de médio retroviral transcriptase foi removido na etapa de lavagem com 11,3 1 mL de PBS 3 vezes. Fix células com paraformaldeído 4% durante a noite a 4 ° C. Na manhã seguinte, lave as células 3 vezes com PBS. Use anticorpos monoclonais de rato para HIV-1 p24 (1:10, Dako, Carpinteria, CA) para visualizar a infecção pelo HIV. Células de imagem em campo claro usando uma objetiva de 40x (Figura 6). 14. Resultados representativos: Droga Tamanho (Nm) PDI Carga (Mv) Surfactantes IDV 1052 0,286 -24,58 0,5% P188, 5,0% SDS sacarose, 9,25% RTV 233 0,273 -7,47 0,5% P188, 9,25% de sacarose ATZ 840 0,192 25,47 0,5% P188, 0,1% MPEG 2000-DSPE, DOTAP de 1,0%, 9,25% de sacarose EFV 347 0,235 -13,52 1,0% PVA Tabela 1. Características físicas de nanoART Tabela mostra valores representativos potencial para as características físicas das formulações nanoART fabricados com os surfactantes indicado. Os valores incluem o diâmetro médio com base na intensidade da luz dispersa, o índice de polidispersão (PDI, uma estimativa da distribuição do tamanho das partículas), e os valores obtidos para o potencial zeta amostras nanoformulation vários. Abreviaturas utilizadas na tabela: IDV: indinavir; RTV: ritonavir; ATV: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: Álcool polivinílico; SDS dodecilsulfato de sódio; P188: poloxamer 188 (também denominado PLURONIC F68); MPEG 2000-DSPE: metil-poli (etileno glicol) 1,2-distearoyl-fosfatidil-etanolamina; DOTAP: (1-oleoil-2-[6 – [(7-nitro-2-1 ,3-benzoxadiazol-4-il) amino] hexanoyl] – 3 trimetilamónio-propano. FIGURA 1. Fluxograma resumindo vários métodos usados para a fabricação de nanoART. A Figura 1 resume vários métodos usados para a fabricação de nanoART. O fluxograma inclui um tempo esperado de colocação para cada uma das fases críticas dos métodos respectivos. FIGURA 2. Imagens representativas da morfologia NanoART desejáveis e indesejáveis. Análise de microscopia eletrônica de varredura (ampliação, 15.000 X) de RTV nanoART produzido pela homogeneização, moagem úmida, e sonicação em cima de um 0,2 mM filtração por membranas de policarbonato. Medida é igual a 2,0 bar M em todos os quadros. NanoART desejável consistem, em média, de pequenos (≤ 2 mm) auto-contidas partículas com bordas lisas que tendem a ter a mesma forma ou similar. NanoART indesejáveis variam muito em tamanho e forma e podem fundir-se e / ou vara um do outro. FIGURA 3. Imagens de solução nanoART desejável e do MDM ocupando nanoART. Imagens de microscopia de campo claro (todos adquiridos utilizando objetiva 20x) de homogeneizado RTV-NP e MDM ocupando nanoART. Depois de combinar 10 mL de RTV-NP com solução de 100 L de PBS em cima de uma lamínula de vidro, as partículas são visíveis e se assemelham a areia com apenas algumas das partículas maiores que são individualmente identificáveis (A). Imagem de totalmente diferenciado e MDM fusiformes antes nanoART tratamento (B). Depois que as células assumiram nanoART, eles se tornam mais escuros e seus núcleos se tornam mais aparentes devido a uma distribuição perinuclear de nanoART, no entanto, eles ainda mantêm a sua forma de fuso corpo celular (C). Uma vez que as células se tornam sobrecarregados com nanoART, os núcleos tornaram-se obscuras, e as células se tornam arredondadas, perdendo sua estrutura fusiformes e, potencialmente, destacando do fundo do poço (D). 4 "/> FIGURA 4. Confirmação de incorporação celular de nanoART em MDM. Microscopia eletrônica de transmissão (ampliação, 15.000 x) demonstra a captação de nanoART em MDM expostos a RTV-NP de homogeneização (A), RTV-NP da moagem úmida (B), RTV-NP de sonicação (C), e células não tratadas (D ). Dentro das células, o nanoART deve ser facilmente identificável pela sua forma geométrica. Nota a falta de quaisquer estruturas geométricas óbvias na célula de controle (D). Um exemplo de cada partícula tem sido descrito: vermelho para homogeneização (A), azul para moagem úmida (B), verde para sonicação (C). Estrutura de partículas deve lembrar o que era visto usando SEM. Medida é igual a 5,0 bar M em todos os quadros. Figura 5. Diagrama de método para testar a eficácia anti-retroviral de nanoART. A fim de testar a capacidade de nanoART para inibir a replicação viral MDM deve ser primeiro tratados com nanoART e depois expostas ao HIV-1 ADA. Semelhante aos estudos de liberação ART, MDM são carregados com nanoART e depois lavados para remover quaisquer partículas que não foram internalizadas. NanoART laden MDM são então cultivadas até 15 dias com um câmbio médio metade a cada dois dias. Durante este tempo (geralmente nos dias 1, 5, 10 e 15) MDM são desafiados com HIV-1 ADA. Após cada exposição viral células são cultivadas por mais 10 dias, a fim de permitir a infecção para o progresso. No dia 10 amostras pós-infecção media são recolhidos para análise e RT células fixadas e coradas para o antígeno p24. Não nanoART MDM tratados, infectados e não infectados, também são cultivadas em paralelo e testados para a presença do antígeno p24 e atividade RT. FIGURA 6. Teste de eficácia nanoART no HIV-1 MDM infectado por coloração p24. Imagens de campo claro (20x objetivo) de RTV-NP tratados MDM 10 dias depois de ser desafiado com HIV-1 ADA. Nenhuma infecção estava presente quando as células foram desafiados com virus1 dia de tratamento pós-nanoART (A); nota a presença de NP no citoplasma da maioria das células (A inset indicado por setas). Infecção estava presente quando as células foram expostas ao vírus 10 dias após nanoART tratamento (B), embora muito menos do que as células não tratadas com nanoART (D); nota a presença de NP mantida em algumas células (B inset indicado por setas), mas menos de 1 dia no tratamento pós-nanoART (A inset). Imagem de células que não eram nem tratados com nanoART nem infectados (C), falta de nota NP dentro citoplasma da célula (C inset). Imagem de células que não foram tratados com nanoART mas expostas ao HIV-1 ADA (D). VIDEO 1. Viva microscopia confocal de células de captação de pobres RTV-NP por MDM. Microscopia de fluorescência de MDM rotulados verde com Vybrant Dio solução da célula-rotulagem e tratadas com vermelho-rotulados RTV-NP. Uma imagem foi tirada a cada 30 segundos para 4 horas com ampliação de 60x. Clique aqui para assistir ao vídeo VIDEO 2. Viva microscopia confocal de células de captação de RTV-NP sucesso pelo MDM. Microscopia de fluorescência de MDM rotulados verde com Vybrant Dio solução da célula-rotulagem e tratadas com vermelho-rotulados RTV-NP. Uma imagem foi tirada a cada 30 segundos para 4 horas com ampliação de 60x. Clique aqui para assistir ao vídeo
