Nanoformulated抗レトロウイルス薬の血液媒介マクロファージのキャリッジのための方法の開発

NanoART製造 1。 NETZSCH MicroCer法による湿式粉砕のNanoART 化学天秤を使用してnanoformulationsを作成し、10 mM HEPES緩衝液、完全に分散するまでT – 18 Ultraturraxをミキサーを用いてpHを7.8にそれらをミックスするために使用される薬剤の結晶と種々の界面活性剤の重量を量る。 2％ – 製剤中の薬物の割合が1の間である必要があります。 連続加工の場合、チラーとコンプレッサーがオンになっていることを確認してください。出口圧力は、工場にサンプルを開始する前に、100 PSI前後となるはずです。 コントロールユニットの電源を入れ、粉砕媒体がタンク内にロードできるように、研削タンクを回転させる。 漏斗を用いて粉砕室にビーズを50mLを追加。メカニカルシールの漏れを避けるために、粉砕室の外側のスレッドまたは任意の場所にはビーズがないことを確認してください。 O -リングは、加工室でその場所にあることを確認します。適切なスクリーンのメッシュサイズを選択し、適切な蓋のアセンブリを使用してナットを締めて、蓋を固定します。スクリーンのメッシュサイズは、ビーズの半分以上のサイズに設定してください。連続的なフライス加工しながらフィルターを目詰まりから製品を避けるために、大画面のメッシュサイズを使用してください。 チャンバーの上部に設けたノブを使用してそれを水平にし、収集容器に製品出口管が空にいることを確認するために粉砕室を下ろします。 製品の入口に界面活性剤の様々な量の薬剤懸濁液を追加します。サスペンションの最小容量は100 mLのはずです。これは、過熱から製粉チャンバーを防止し、また部品の故障率の低下に起因するビーズ汚染を避けることができますコントロールユニットを使用してポンプを起動します。あなたの製剤（ – 150 mL /分〜50）のために必要に応じて流量を変えることができる。 アジテーターの電源をオンにし、コントロールユニットに速度を調整する。速度はMicroCerで620 rpmから4320 rpmまで増やすことができます。粉砕室の上部に取り付けられ、過熱がないことを確認されている温度計を使用して温度を監視します。 様々な速度と流量でミルサンプルをと回折光散乱ブルックヘブンサイザー（表1）を使用してサイズと電荷の測定のための製剤の小アリコート（〜1 mL）を取り出してください。 希望のサイズを取得した後、コントロールユニットを使用して加工を停止する。まだ上にポンプで、フラスコに試料を収集する。薬が完全にサンプル採取フラスコに流して下さい。 ポンプの電源を切ります。ビーズを削除するには、ユニットの下に回収トレイを置きます。蓋のアセンブリの前面プレートのナットを緩めてトレイにビーズを収集する。フロントプレートを外し、トレイにビーズを洗浄するために脱イオン水のボトルを使用してください。 50 mLの遠心管に粉砕された懸濁液を移すと30分間、10,000 rpm（10174 RCF）に遠心分離機を設定します。遠心サイクルの完了時に、上清の量を測定し、新鮮な界面活性剤溶液の同じ量で置き換えてください。 再懸濁が完了すると、粉砕室と10分間粉砕して懸濁液を移す。アリコートを（〜1mLの）取るとサイザー（表1）を使用して、再度サンプルの大きさと電荷を測定する。 脱イオン水および70％エタノールを使用してMicroCerの使用後の洗浄を行います。 HPLCを使用してnanoART製剤の濃度を測定する。私たちのケースでは、C8ガードカートリッジとYMCオクチルC8カラム（ウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ州）にトリプリケート20μL注入を用いて逆相HPLCによりサンプルを評価した。 48％アセトニトリル/ 52パーセント25mMのKH 2 PO 4、pHは4.15で構成される移動相は、272 nmでのUV / VIS検出、0.4 mL /分でポンプされる。すべての薬剤の測定では、定量は、メタノールで調製した各遊離薬物（0.025〜100μg/ mLの）の標準曲線との比較によって決定されます。 2。 Avestin EmulsiFlex C5を使用してNanoARTの均質化化学天秤を使用してnanoformulationsを作成し、10 mM HEPES緩衝液、完全な分散を得るためにT – 18 Ultraturraxをミキサーを用いてpHを7.8にそれらをミックスするために使用される薬剤の結晶と種々の界面活性剤を測定します。 均質化容器への懸濁液を移すと再循環を開始します。チラーは、サンプルを均質化する開始する前にオンになっていることを確認してくださいメートルが20,000 ± 2,000 psiを読み込み、ターゲットの粒径が達成されるまで均質化し続ける徐々にまで圧力を上げます。 60分 – これは通常45との間に取ります。定期的にアリコートを（〜1mLの）取るとサイザー（表1）を使用して、サンプルの大きさと電荷を測定する。 ホモジナイザーから50 mLの遠心管に均質化した懸濁液を移すと、30分間10,000回転（10174 RCF）に遠心分離機を設定します。の完了時遠心サイクルは、上清の量を測定し、新鮮な界面活性剤溶液の等量と交換してください。 再懸濁後、C5ホモジナイザーに懸濁液を移す。循環を再起動し、20,000 ± 2,000 psiに均質化圧力を返し、30分間ホモジナイズする。ゼータサイザー（表1）を使用して製剤の大きさと電荷を測定します。 溶媒として脱イオン水とエタノールとのユニットの後のクリーニングを実行します。 HPLCを使用してサンプルの濃度を測定する。 3。コー​​ルパーマー超音波プロセッサを使用して超音波処理ガラスビーカーに50mlのジクロロメタンを測定します。完全な溶解が観察されるまで、分析天秤、ジクロロメタンに追加する、とのミックスを使用して、ポリ（乳酸 – コ – グリコール酸）の6グラム（PLGA）を測定します。 薬物の結晶1.25 gを測定し、ジクロロメタン/ PLGAのソリューションに追加します。完全な溶解を得るために混ぜる。 1％のポリビニルアルコール（PVA）界面活性剤溶液を作成し、氷浴を使用して、それを冷却します。界面活性剤溶液は、溶解薬を含む有機溶液を添加する前にクールであることを確認してください。 1パーセントPVAの界面活性剤溶液中に薬液を注ぐと50％の振幅でultrasonicatorを開始します。界面活性剤溶液を氷浴内に配置されていることを確認します。ソニケーターの振幅は、サンプルの小さなバッチのための〜30％の振幅に減少させることができます。 10分間サンプルを超音波処理してください。 粒度分析（表1）のための小アリコート（〜1 mL）を取り出してください。粒子の大きさは1.5μmより大きい場合は、合計16分までに最大2分間隔でサンプルを超音波で分解する。 20倍とドキュメントの観察（図1A）で顕微鏡下で試料を観察。 残りのサスペンションのための十分な渦を作成し、室温で一晩混合を継続して攪拌プレートを使用してください。 フラスコに8グラムのマンニトールを秤量し、80mLのRO水を加える。完全な溶解が観察されるまで混合し、室温で保管してください。サンプルは凍結乾燥する必要がある場合、これは遠心分離後に再懸濁のために使用されます。 24時間後、懸濁液を収集し、50 mLの遠心管に注ぐ。 5で20分間8,000 rpmでの速度で試料を遠心℃にフィルタリングされた逆浸透（RO）水および0.5％セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）界面活性剤75mLの、他の半分の75 mLの上澄みを再懸濁します半分のサンプルをデカント。 5℃で20分間8,000 rpmの速度で再びサンプルを遠心し、20mLのマンニトール溶液の合計とペレットのそれぞれを懸濁します。 第二再懸濁後、ゼータサイザーを用いて粒子の大きさ（表1）を測定する。 残りのサスペンションを転送し、凍結乾燥機にそれらを配置する適切なバイアルを使用してください。 HPLCを使用してサンプルの濃度を測定する。 4。 NanoARTの形態 nanoARTサスペンションをとると簡単に超音波プローブを用いて5秒間20％の振幅で超音波処理。 10秒間を1.7 mLのマイクロ遠心チューブや渦内のRO水1.5 mLに懸濁液10μLを転送する。 水nanoARTソリューションと0.2μmのポリカーボネートのろ過膜（Nucleporeトラックエッチ）を使って組み立てSwinnex 13ポリプロピレン製フィルターホルダーで構成されるろ過装置への転送50μLのサンプルを取る。ろ過装置は、希釈薬剤懸濁液の添加前に蒸留水をフィルタリング50μL0.2μmのと準備されている。ソリューション全体のボリュームが完全にろ過膜を越えて引かされるまで真空は、装置に適用されます。 膜が乾燥したら、それは二重スティック導電性カーボンテープを使用してアルミのピンのスタブに固定され、パラジウムでコーティングスパッタ。試料のスタブは、私たちの場合、JEOL JSM6300F低電圧、電界放出走査型電子顕微鏡（図2）で、使用して結像される。 5。 NanoARTの可視化準備nanoART懸濁液を取り、超音波プローブで20％の振幅で10秒間、それらを超音波処理。 顕微鏡のスライドカバースリップを取るし、倒立顕微鏡上に置きます。カバースリップ上のリン酸100μLとnanoARTサスペンションの15μLの緩衝生理食塩水（PBS）と数回ピペッティングして混合ミックス。 20倍対物レンズ（図3）を使用してナノ粒子を可視化する。 nanoARTの生物学 6。血液媒介単球と単球由来マクロファージ（MDM）の単離と準備 HIV – 1及び肝炎の抗体陰性のドナーからの白血球除去輸血によるヒト単球を取得し、向流遠心水簸により細胞を精製する。抗CD68（クローンKPで免疫標識によって、細胞の純度を評価するライト染色cytospins 1から-1）。 10％の熱不活化プールしたヒト血清、1％グルタミン、50μg/ mlのゲンタマイシン、10μg/ mLのシプロフロキサシン及び1 × 10の濃度1000 U / mLの組み換えヒトマクロファージコロニー刺激因子（MCSF）を添加したDMEMで単球を精製した文化37 6細胞/ mL℃、5％CO 2の加湿雰囲気下でC。プレート7日間用6ウェルプレートや培養細胞のウェル当たり2 × 10 6個の細胞単球がマクロファージ1に区別できるようにするため。 （図3A） 7。細胞取り込みとコレクション 100μMの最終濃度になるように培地でnanoARTを（MCSFせずに）混合し、各ウェルに治療の培地1 mLを加える。 時刻の時点、またはときに細胞が完全にnanoART（図2）でロードされるを希望する、すべての治療の培地を除去し、細胞に取り込まれていない任意の粒子を除去するために1 mLのPBSで細胞を3回洗浄。 1mlのPBSで、細胞のリフターを使用してウェルの底から接着細胞を除去し、1.7 mLのマイクロ遠心チューブ2から4にそれらを置きます。 4 1,000 rcfで、細胞を遠心分離℃で10分間を。上清を除去し、100％メタノール200μLを加える。細胞を溶解し、20％の振幅で超音波処理プローブでペレットを超音波処理（2-5秒）短時間でnanoARTを溶かす。 -80で保管サンプル° Cの薬物含有量を分析する準備が整うまで。 8。 NanoARTの細胞内保持として7.1で説明MDMを扱います。 希望する時点で、7.2で述べたように細胞を洗浄、その代わりに、すぐに細胞を掻き取り、0.1 Mリン酸緩衝液で3％グルタルアルデヒド液（pH7.4）の溶液に、室温で15分間細胞を固定し、さらに10のためにそれらを修正0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）で1％四酸化オスミウムと分。 として7.2で述べた1mLのPBSで固定し、こすり細胞を取り外します。また、収集し、7.2で説明するように細胞を遠心分離し、その代わりにペレットにメタノールを加えることで、グルタルアルデヒド固定液の溶液200μLを加える。 ミクロトームで薄い（80nm以下）のセクションに細胞ペレットをカット。酢酸ウラニルとクエン酸鉛でセクションを染色。透過型電子顕微鏡（図4）を用いて染色した切片を観察。 9。 ARTリリース 7.1から7.2で説明したように細胞を扱うが、代わりに洗浄後、細胞を収集、MCSFなしとnanoARTなし2mLの細胞培養培地とPBSを交換してください。 指定された日には、またはのような培地の黄色、交換の半分を回し、細胞培養培地で示されます。 7.2から7.3の説明に従って、使用する日で、​​複製の細胞と一緒に細胞の培地1mLを収集する。 プロセスセルは、7.3で説明した。 10秒間フルスピードで100％のメタノールとボルテックスを1 mLに培地サンプル150μLを添加することによりプロセス媒体。その後、10分間21000 rcfでサンプルを遠心する。上清を除去し、新しいチューブに移す。真空遠心機でメタノールを蒸発させる、これは1からサンプルに応じて4時間ほどかかることがあります。 -80 ° Cの薬物分析のための準備ができるまでストアサンプル。 10。共焦点顕微鏡によるNanoARTのリアルタイム取り込みステップ6.2とラベルから成熟したMDMを取る製造の命令の次のVybrant細胞標識のソリューションのような細胞標識溶液を使用してセル。細胞の余分な色素を除去するために培養液1 mLを用いて3回すすいでください。 蛍光標識nanoARTを使用して、ステップ7.1のように培地でnanoARTを混ぜる。 共焦点顕微鏡とイメージングの直前にラベル付けnanoARTで処理媒体を追加。画像の60倍の目標5（動画1＆2）を使用して4時間、30秒ごとにキャプチャします。 HIV – 1感染及び感染性アッセイ 11。 HIV – 1 ADA感染 9.1から9.3で説明したように細胞を扱います。 希望する日には、すべての培地を除去し、24時間1 0.01ウイルス粒子/細胞とインキュベートの感染多重度でHIV – 1 ADAを含む、MCSFなく、培地に交換してください。ウイルス培養液を除去し、新鮮な、ウイルスフリーのメディアと交換してください。 10日間の培養細胞はすべての他の半日培地を交換または6（図5）細胞が生き続けるために、必要に応じて。 十日後の感染は、96ウェルプレートに各ウェル、場所から培地10μLを収集し、-80℃で保存レトロ（逆）転写酵素の分析を実行する準備が整うまで。 12。逆転写酵素（RT）アッセイステップ11.3から各10μLのサンプルで、100mMのトリス- HCl（pH 7.9）、300mMのKCl、10mMのDTT、0.1％ノニルphenoxylpolyethoxylethanol – 40（NP – 40）、及び水を含む溶液10μLを混合する。 37 ° C 7で15分間、この混合物をインキュベートする。 <l私は>その後、50mMのトリス- HCl（pH 7.9）、150mMのKClを、5mMのDTT、15 mMのMgCl 2、0.05％NP – 40、10μg/ mLのポリ（A）、0.250を含む溶液25μLを追加37 U / mLのオリゴd（T）12-18、そして各ウェルでインキュベート〜10μCiの/ mLの3 H – TTP℃で18時間7℃。 インキュベーション後、各ウェルに氷冷10％トリクロロ酢酸（TCA）の50μLを加える。ガラス繊維フィルター上に井戸を収穫し、β-シンチレーション分光法7による3 H – TTPの取り込みのためのフィルタを評価する。 13。 HIV – 1p24検出レトロウイルス転写媒体のサンプルをPBSで3回1mLで洗浄して、手順11.3で削除された複製細胞を洗浄。 4℃で一晩4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定℃に翌朝は、PBSで細胞を3回すすいでください。 HIV感染を可視化する（1:10、Dako社、カーピンテリア、カリフォルニア州）HIV – 1 p24をするマウスモノクローナル抗体を使用してください。 40倍対物レンズ（図6）を使用して、明るいフィールドの下に画像細胞。 14。代表的な結果： 薬 サイズ （NM） PDI 担当 （MV） 界面活性剤 IDV 1052 0.286 -24.58 0.5パーセントP188、5.0％SDS、9.25パーセントのスクロース RTV 233 0.273 -7.47 0.5パーセントP188、9.25パーセントのスクロース ATZ 840 0.192 25.47 0.5パーセントP188、0.1％MPEG 2000 – DSPE、1.0％のDOTAP、9.25パーセントのスクロース EFV 347 0.235 -13.52 1.0パーセントPVA 表1。nanoARTの物理特性表は、指定された界面活性剤を使用して製造さnanoART製剤の物理的特性のための潜在的な代表値が表示されます。値は、散乱光の強度、多分散性指数（PDI、粒径の分布の推定値）、および様々なnanoformulationのサンプルについて得られたゼータ電位の値に基づいて、平均直径が含まれています。テーブルで使用される略語：IDV：イン​​ジナビル、RTV：リトナビル、ATV：アタザナビル、EFV：effavirenz、PVA：ポリビニルアルコール、SDSのドデシル硫酸ナトリウム、P188：ポロクサマー188（また、プルロニックF68と呼ぶ）、MPEG 2000 – DSPE：メチル – ポリ（エチレングリコール）、1,2 – ジステアロイル – ホスファチジル – エタノールアミン、DOTAP：（1 – オレオイル-2 – [6 – [（7 – ニトロ- 2 – 1 ,3 – benzoxadiazol -4 – イル）アミノ]ヘキサノイル] – 3 -トリメチルアンモニウムプロパン。 図1。nanoARTを製造するために使用される様々な方法をまとめたフローチャート。 図1は、nanoARTを製造するために使用されるさまざまなメソッドを示します。フローチャートは、それぞれの方法のクリティカルフェーズのそれぞれの予想される時間配分が含まれています。 図2。望ましいと望ましくないNanoARTの形態の代表画像。均質化、湿式粉砕、および0.2μmのポリカーボネート製濾過膜の上に超音波処理によって生成されたRTV nanoARTの電子顕微鏡分析を（倍率、15,000 X）スキャン。測定バーはすべてのフレームで2.0μm以下と等しくなります。望ましいnanoARTは、同じまたは類似の形状を持つ傾向がある滑らかなエッジを持つ自己完結型（≤2μm）の微小粒子の、平均的に、構成されています。望ましくないnanoARTは、サイズと形状の両方に大きく変化し、相互に及び/またはスティックを融合させるのです。 図3。望ましいnanoARTソリューションのとMDMがnanoARTを占めての画像。均質化したRTV – NPとMDMの明視野顕微鏡像は、（すべての20倍の対物レンズを用いて取得した）nanoARTを占有。ガラス製カバースリップの上のPBS 100μLでRTV – NP溶液10μLを組み合わせた後、粒子が目に見えるものであり、（）個々に識別可能であることも大きい粒子の数と砂に似ている。 nanoART治療（B）の前に完全に分化し、紡錘状のMDMの画像。細胞がnanoARTを撮影した後は、彼らが暗くなったり、それらの核はnanoARTの核周辺分布に起因するより明らかになる、しかし、彼らはまだ彼らの紡錘状の細胞体（C）を維持する。一度細胞がnanoART、隠さなる原子核で過負荷になる、と細胞が丸くなって、それらの紡錘状の構造を失い、潜在的に（D）井戸の底からデタッチ。 / 4"> 図4。MDMにnanoARTの細胞取り込みの確認。透過電子顕微鏡（倍率、15,000 x）は超音波処理（C）からRTV – NP、および未処理細胞（D、湿式粉砕（B）からRTV – NP、均質化（）からRTV – NPに曝露したMDMにnanoARTの取り込みを示しています）。細胞内で、nanoARTはその幾何学的形状により容易に識別可能でなければなりません。コントロールのセル（D）の任意の明白な幾何学的構造の欠如に注意してください。各粒子の例はアウトライン化されています：ホモジナイズ用赤（）、湿式粉砕（B）、超音波処理のための緑（C）のための青。粒子構造は、SEMを使用して見られたことのようになります。バーがすべてのフレームで5.0μmのに等しい測定します。 図5。nanoARTの抗レトロウイルス効果をテストするための方法の図。ウイルス複製のMDMを阻害するためにnanoARTの能力をテストするために、最初nanoARTで処理し、HIV – 1 ADAにさらされている必要があります。 ARTのリリースの研究と同様に、MDMはnanoARTでロードし、内面化されていないすべての粒子を除去するために洗浄される。 NanoART含んだMDMは、一日おきに半分の培地を交換して15日前まで培養する。この時間の間（一般的には1日目、5、10、および15）MDMは、HIV – 1 ADAに迫られています。各ウイルスの曝露細胞は、感染が進行することを可能にするために、別の10日間培養された後。一日に10、感染後のメディアサンプルは、RTの分析と固定し、p24抗原のために染色された細胞のために収集されます。非nanoART扱わMDM、感染および非感染の両方が、また並行して培養し、p24抗原とRT活性の存在について試験されています。 図6 P24染色によるHIV – 1感染MDMのnanoART有効性のテスト。 RTV – NPの明視野像では（20倍対物レンズ）10日間のHIV – 1 ADAで攻撃された後、MDMを扱う。細胞がvirus1日後nanoARTの治療（）でチャレンジしたときには感染は存在しなかった、（挿入図の矢印で示される）、ほとんどの細胞の細胞質内にNPの存在に注意してください。いくつかのセルのNPの維持の存在を（挿入図Bは矢印で示される）に注意してください、しかし、感染は細胞が10日nanoART処理（B）の後にウイルスにさらされた時がずっと少ないのでnanoART（D）で処理していない細胞に比べて、存在していた1日目後nanoART処理（挿入図）よりも少ない。どちらもnanoARTも感染（C）で処理されなかった細胞の画像、細胞質内のNPのノート欠如（C挿入図）。 nanoARTで治療がHIV – 1 ADA（D）にさらされていない細胞のイメージ。 VIDEO 1。MDMによって貧しいRTV – NPの取り込みの細胞共焦点顕微鏡のライブ。 MDMの蛍光顕微鏡は、Vybrant DIO細胞標識溶液で緑のラベルが付けられ、RTV – NP赤い標識で処理。一つの画像は60倍の倍率で4時間ごとに30秒を取られた。 ビデオを見るためにここをクリック VIDEO 2。MDMによって成功したRTV – NPの取り込みの細胞共焦点顕微鏡のライブ。 MDMの蛍光顕微鏡は、Vybrant DIO細胞標識溶液で緑のラベルが付けられ、RTV – NP赤い標識で処理。一つの画像は60倍の倍率で4時間ごとに30秒を取られた。 ビデオを見るためにここをクリック