方法Nanoformulated的抗逆转录病毒药物的血源性巨噬细胞运输的发展

NanoART制造 1。 NETZSCH MicroCer方法湿磨NanoART 称取药物的结晶和各种表面活性剂，将用于nanoformulations使用分析天平和10 mM的HEPES缓冲液，pH值7.8使用T – 18 Ultraturrax调音台，直至完全分散混合。在制定该药物的％应在1 – 2％之间。 对于连续铣削，确保冷水机组和压缩机。出口压力应开始磨你的样品之前，大约100 PSI。 打开控制单元，使研磨介质，可装载在坦克和旋转的研磨罐。 添加50毫升的珠子粉碎室，利用一个漏斗。确保有研磨腔以外的线程或任何没有珠子，以避免在机械密封泄漏。 确保O形圈在其研磨腔。选择一个合适的筛网的大小和使用适当的盖子大会和安全的盖子，拧紧螺母。筛网的大小应至少有一半的珠子的大小。使用大屏幕的网目尺寸，以避免堵塞过滤器而连续铣削的产品。 降低研磨室，使横向使用室顶部的旋钮，并确保产品出口管进入收集容器清空。 添加不同量的表面活性剂产品入口药物停用。暂停的最低量应该是100毫升。这将防止过热研磨腔，也避免因零件磨损少珠污染启动泵使用的控制单元。流速为您的配方（〜50 – 150毫升/分钟）的要求，可以是多种多样的。 打开搅拌器和速度控制单元上的调整。从620转的速度可提高到4320 MicroCer的转速。监测温度，使用温度计附着在上面的研磨腔，并确保有没有过热。 穆勒以不同的速度和流速的样品，并采取了制定使用衍射光散射布鲁克海文国家实验室的激光粒度仪（见表1）的大小和电荷测量等分的小（〜1毫升）。 获得所需的大小后，停止使用控制单元的铣床。泵，一个烧瓶中收集到的样本。允许的药物，以完全排入样品采集瓶。 关闭泵。要消除的珠子，地方单位收集盘。松开前面板上的盖子大会上的螺母，并收集在托盘的珠子。起飞前板，并使用去离子水瓶，洗珠入盘内。 转移到50 mL离心管球磨悬挂和设置离心机10,000 RPM为30分钟（10174 RCF）。离心机周期完成后，测量上清液的数量和相同数量的新鲜表面活性剂溶液取代。 一旦再悬浮完成后，将暂停10分钟的研磨腔和磨。等分（1ML），并再次测量的大小和样品费，使用激光粒度仪（见表1）。 执行MicroCer使用去离子水和70％的乙醇后使用清洁。 测量浓度采用HPLC nanoART配方。在我们的例子中，我们评估样品反相高效液相色谱法使用一式三份到一个YMC辛基C8柱与C8保护柱（WATERS公司，米尔福德，马萨诸塞州）20μL，注射。流动相组成为48％乙腈/ 52％25mm的KH 2 PO 4，pH值4.15，0.4毫升/分钟，在272纳米的紫外/可见检测的泵浦。所有药物的测量，定量确定的每一个免费的药物（0.025-100微克/毫升）的甲醇配制的标准曲线比较。 2。 NanoART同质化使用Avestin EmulsiFlex C5 衡量药物的晶体和各种表面活性剂将用于nanoformulations使用分析天平和10 mM的HEPES缓冲液，pH值7.8使用T – 18 Ultraturrax龙头，以获得完整的分散混合。 传输的悬浮液的均质容器，并开始回流。确保冷水机组开始前均质样品增加的压力，才渐渐米读取20000 ± 2000 PSI，继续同质化，直到实现目标粒径。这通常需要45 – 60分钟之间。定期采取等份（约1毫升）和测量使用激光粒度仪（见表1）样本的规模和负责。 匀浆器匀浆悬浮转移至50 mL离心管中，并设置离心机10,000 RPM为30分钟（10174 RCF）。完成后离心机的周期，测量上清量，更换新鲜的表面活性剂溶液等体积。 再悬浮后，将悬挂在C5匀浆。重新启动的流通和20000 ± 2000 PSI返回均质压力为30分钟，均质。测量使用的激光粒度仪（见表1）制定的大小和电荷。 执行的单位后，与去离子水和乙醇为溶剂清洗。 测量使用高效液相色谱法样品的浓度。 3。超声使用科尔帕默超声处理器测量一个玻璃烧杯50 mL二氯甲烷。测量6克聚（乳酸 – 乙醇酸）（PLGA）使用分析天平，添加二氯甲烷，搅拌至完全溶解观察。 测量1.25克毒品晶体，并添加二氯甲烷/ PLGA的解决方案。组合，以获得完全溶解。 1％的聚乙烯醇（PVA）表面活性剂的解决方案，并用冰浴冷却。确保除了包含溶解药物的有机溶液，表面活性剂溶液冷却后再。 1％PVA表面活性剂溶液倒入药物溶液，并开始在50％幅度的ultrasonicator。确保表面活性剂溶液，放置在冰浴。 sonicator幅度可以减少〜30％的幅度为小批量的样品。超声为10分钟的样品。 取出一个小粒度分析（见表1）等分（〜1毫升）。如果粒子的大小是大于1.5微米，超声样品在2分钟的时间间隔最多共16分钟。在20X和文件的意见（图1A），在显微镜下观察的样本。 使用搅拌板创建其余悬挂提供足够的旋涡，并继续在室温下混合过夜。 称取8克甘露醇烧瓶，添加80毫升的RO水。混合直到完全溶解，并在室温下保存。这将用于离心后，如果样品需要冻干再悬浮。 收集24小时后暂停，并倒入50 mL离心管。样品离心20分钟8000转的速度在5 ° C。 75毫升过滤反渗透（RO）水和75毫升0.5％的十六烷基三甲基铵（CTAB）表面活性剂的另一半，倒出上清，悬浮其中一半的样本。 再次在20分钟8000转的速度离心样品在5 ° C，共20毫升甘露醇溶液重悬颗粒。 第二次再悬浮后，测量使用激光粒度仪（见表1）粒子的大小。 使用合适的小瓶，把剩余的悬浮液，并放入冻干机。 测量使用高效液相色谱法样品的浓度。 4。 NanoART形态采取nanoART悬挂和简要超声5秒用一个超声探头在20％的幅度。转移到1.5 mL的RO水10μL的悬浮液，在1.7 ml离心管和10秒的旋涡。 以水的nanoART解决方案，并转移到一个Swinnex 13 0.2μm的聚碳酸酯滤膜（Nuclepore轨道蚀刻）聚丙烯过滤器组装持有人组成的一个过滤装置的50μL样品。过滤装置是与50μL的0.2微米过滤蒸馏水稀释药物悬挂前催芽。真空，然后将其应用于仪器，直到整个溶液的体积已经完全拉过去的过滤膜。 一旦膜是干的，它是铝针存根使用双节棍导电碳胶带贴和溅射涂层与钯。标本存根，然后成像的JEOL JSM6300F低电压，场发射扫描电子显微镜（图2），在我们的情况下，使用。 5。 NanoART可视化以准备nanoART悬浮液和超声为10秒，他们用一个超声探头在20％的幅度。 载玻片盖玻片，放置在一个倒置显微镜。 15μL与100μL磷酸盐nanoART悬挂在盖玻片混合缓冲液（PBS）和混合移液器向上和向下几次。使用20倍的目标（图3）可视化的纳米粒子。 对nanoART的生物学 6。血源性单核细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞（MDM）的分离和制备人力leukapheresis从HIV – 1和肝炎血清阴性的捐助者获得的单核细胞和净化的细胞逆流离心淘洗。评估抗CD68（克隆KP免疫标记细胞纯度-1），赖特 – 染色cytospins 1。 辅以10％热灭活汇集人类血清，1％谷氨酰胺，50微克/毫升庆大霉素，10微克/毫升环丙沙星和1000 U / mL的重组人巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）DMEM培养液培养纯化单核细胞在浓度为1 × 10 6细胞/ mL，在37 ° C在与5％的CO 2饱和湿度。板每孔2 × 10 6细胞在6孔板和培养细胞中，以7天为使单核细胞分化成巨噬细胞1。 （图3A） 7。细胞摄取及征收与培养基混合nanoART（无MCSF）至终浓度为100μm和治疗液添加1毫升，每口井。 在所需的时间点，或细胞完全符合nanoART（图2）加载时，删除所有治疗介质，并用1 mL PBS洗涤细胞3次，以去除颗粒细胞在尚未采取。在1 mL的PBS液，删除通过使用一个细胞升降机井底的贴壁细胞和它们放入1.7 ml离心管2-4。 离心机在1000 RCF的细胞在4 ° C下10分钟。去除上清，加入200μL100％甲醇。裂解细胞，溶解简要nanoART（2-5秒），用一个超声探头超声沉淀在20％的幅度。商店样品-80 ° C直到准备来分析药物含量。 8。细胞内保留的NanoART 治疗如7.1中所述的MDM。 在所需的时间点，洗如7.2中所述的细胞，但立即刮单元格，而不是固定在0.1 M磷酸缓冲液（pH值7.4）的3％戊二醛溶液在室温下15分钟的细胞，并进一步修复10 10分钟，在0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）中，用1％四氧化锇。 删除固定液在1 mL PBS和刮细胞如7.2中所述。此外，收集和离心机在7.2中描述的细胞，但加入甲醇沉淀，而不是添加戊二醛固定液200μL。 一个切片，切成薄（80 nm）的部分细胞沉淀。用醋酸铀和柠檬酸铅染色的部分。观察染色切片使用透射电子显微镜（图4）。 9。艺术发行治疗细胞在7.1-7.2描述，但是，洗涤后收集细胞，而不是取代PBS 2 mL细胞培养基无MCSF没有nanoART。 在表示天，或如细胞培养转向黄色，一半的介质交换的介质。 在所需的一天，收集1 mL的细胞液中中，以及在7.2-7.3所述的复制细胞。 在7.3中描述的过程单元。中等样品150μL，加入1毫升100％甲醇和10秒的全速涡的过程介质。然后离心10分钟，在21000 RCF的样本。去除上清转移到新管。甲醇蒸发真空离心机，这可能需要从1到4小时，根据样品。商店样品在-80 ° C，直到准备好药物分析。 10。共聚焦显微镜实时摄取的NanoART 从成熟的MDM 6.2步骤和标签使用电池的标签解决方案，如Vybrant细胞标记解决方案制造的指令后的细胞。冲洗细胞3次，用1毫升培养液中，以消除任何多余的染料。 与培养基混合，在步骤7.1中使用荧光标记的nanoART nanoART。 添加标记nanoART前夕共聚焦显微镜成像处理介质。使用60X的目标5（视频1＆2）4个小时，每30秒拍摄图像。 HIV – 1感染和感染性的实验 11。 HIV – 1 ADA的感染治疗在9.1-9.3所述的细胞。 所需的天数，删除所有中等和中等更换，没有MCSF，包含在0.01病毒颗粒/细胞孵育24小时1的多重感染HIV – 1 ADA的。删除病毒的媒介和更换新鲜，无病毒的传播媒介。 10天培养细胞交换的一半中期隔日或在必要时保持细胞存活（图5）6。 感染后的十天收集10μL介质从每口井，地点在96孔板，并储存在-80 ° C，直到准备好执行逆转录病毒（反向）转录分析。 12。逆转录酶（RT）的含量每个步骤11.3 10μL样品，10μL一个解决方案，包含100毫米的Tris – HCl（pH值7.9），氯化钾300毫米，10毫米数码地面电视，0.1％，壬基酚phenoxylpolyethoxylethanol – 40（NP – 40），和水混合。孵育15分钟，这种混合物在37℃7。 <l我>然后添加25μL的解决方案，其中包含50毫米的Tris – HCl（pH值7.9），氯化钾150毫米，5毫米数码地面电视，MgCl 2的 15毫米，0.05％NP – 40，10微克/毫升聚（一），0.250寡核苷酸的U / mL的D（T）12-18，和10μCi/ 毫升 3的H – TTP的每口井和孵化，在37 ° C时18小时7 。 孵化后，每孔加50μL冰冷的10％三氯乙酸（TCA）的。收获到玻璃纤维过滤器的井，并评估β-闪烁光谱7 3H – TTP的法团的过滤器。 13。 HIV – 1p24侦测洗净从逆转录病毒酶液样品1 mL的PBS 3次液冲洗步骤11.3删除复制细胞。 一夜之间修复细胞，用4％多聚甲醛4 ° C。第二天早晨，用PBS冲洗细胞3次。 使用鼠标的HIV – 1 P24（1:10，Dako公司，Carpinteria的CA）的单克隆抗体，感染艾滋病毒的可视化。明场下的图像细胞，使用40倍的目标（图6）。 14。代表性的成果： 药物 尺寸 （NM） 交车 充电 （MV） 表面活性剂 IDV 1052 0.286 -24.58 P188，5.0％SDS，9.25％，蔗糖0.5％ 室温 233 0.273 -7.47 P188，0.5％，9.25％蔗糖 ATZ 840 0.192 25.47 P188 0.5％，0.1％MPEG 2000 – DSPE，1.0％DOTAP，9.25％蔗糖 EFV 347 0.235 -13.52 1.0％PVA nanoART物理特性见表1。 表显示使用指定的表面活性剂生产nanoART配方的物理特性，潜在的代表值。值包括根据散射光的强度，多分散指数（PDI，粒度分布的估计），以及各种nanoformulation样品获得的zeta电位值的平均直径。在表中使用的缩写：IDV：茚; RTV：利托;亚视：阿扎那韦; EFV：effavirenz;聚乙烯醇：聚乙烯醇; SDS十二烷基硫酸钠; P188：泊洛沙姆188（也称为聚醚F68），MPEG 2000 – DSPE：聚甲基（1,2 – 乙烯 – 乙二醇）distearoyl -磷脂乙醇胺; DOTAP：（1 -油酰- 2 – [6 – [（7 – 硝基- 2 – 1 ,3 – benzoxadiazol -4 – 基）氨基] hexanoyl] – 3 – 三甲基丙烷。 图1总结用于制造nanoART各种方法的流程图。 图1总结了各种方法用来制造nanoART。流程图包括各自方法的每个关键阶段的预期时间分配。 图2。受欢迎和不受欢迎的NanoART形态的代表图像。 ，扫描电子显微镜分析的RTV nanoART（放大倍率，15000 X）生产的同质化，湿磨，超声​​和0.2μm的聚碳酸酯滤膜上。测量栏等于2.0微米的所有帧。可取nanoART组成，平均而言，小（≤2微米）自足的颗粒，边缘光滑往往有相同或相似的的形状。不良nanoART的大小和形状差别很大，保险丝和/或粘到另一个。 图3。可取nanoART解决方案和MDM的高达nanoART的图像。明场显微镜图像（所有使用20倍的目标收购）的匀浆的RTV – NP和MDM高达nanoART。一个玻璃盖滑的顶部与100μL的PBS 10μLRTV – NP的解决方案相结合后，粒子是可见的，只有几个较大的颗粒被单独识别（一）类似的沙子。图像完全分化和主轴nanoART治疗前（二）形的MDM。后，细胞已nanoART，他们变深，其原子核变得更加明显，由于nanoART核周分布，但是，他们仍然保持他们的主轴形细胞体（C）。一旦细胞超载与nanoART，变得模糊不清的核;细胞变得圆润，失去了自己的主轴形结构，并可能从底部以及（四）分离。 4“/> 图4。nanoART蜂窝纳入到MDM的确认。透射电子显微镜（放大倍率，15000 X）演示湿磨（二），超声（三）RTV – NP的，未经处理的细胞和（D从同质化（A）的RTV – NP暴露的RTV – NP的MDM nanoART摄取）。 nanoART细胞内，应易于识别其几何形状。请注意没有任何明显的几何结构，在控制细胞（四）。已经概述了每个粒子的一个例子：为同质化（一）红色，蓝色为湿磨（二），（三）超声绿色。颗粒结构应类似，这是使用SEM。测量栏等于5.0微米的所有帧。 图5。nanoART抗逆转录病毒药物的疗效测试方法示意图。为了测试nanoART能力，抑制病毒复制的MDM必须首先与nanoART治疗，然后暴露于HIV – 1 ADA的。类似的艺术释放研究，MDM与nanoART加载，然后洗净，以消除任何没有内在的颗粒。 NanoART载货MDM再培养一个半换液隔日至15天。在这段时间内（一般为1天，5，10和15）的MDM与HIV – 1 ADA的挑战。每个病毒接触细胞培养后，再过10天，以便感染的进展。第10天感染后的媒体样本收集RT分析和p24抗原的固定和染色的细胞。非nanoART处理MDM中，感染和未感染，也培养并行存在p24抗原和RT活性测试。 图6。HIV – 1感染的MDM P24染色nanoART效果的测试。 RTV – NP（20X目标）明场图像处理的MDM后10日内与HIV – 1 ADA的挑战。无感染时存在细胞virus1一天后nanoART治疗（一）挑战;注意的NP的大多数细胞（插图用箭头表示）细胞质内的存在。当细胞暴露nanoART治疗（二）后10天病毒感染目前，虽然少得多比不nanoART治疗的细胞（D），注意保持的NP在某些细胞（乙插图用箭头表示）的存在，但少于每日1次后nanoART治疗（插图）。既不nanoART也不感染（三）处理的细胞图像;注意缺乏细胞的细胞质内的NP（插图）。没有与nanoART治疗，但暴露于HIV – 1 ADA（四）的细胞的图像。 视频1。活细胞MDM共聚焦显微镜差RTV – NP的摄取。 MDM的荧光显微镜Vybrant迪欧细胞标记的解决方案，并标有绿色，红色标记的RTV – NP治疗。一个图像60X放大倍率为4小时，每隔30 秒点击这里观看视频 视频（2）活细胞共聚焦显微镜成功的RTV – NP MDM的摄取。 MDM的荧光显微镜Vybrant迪欧细胞标记的解决方案，并标有绿色，红色标记的RTV – NP治疗。一个图像60X放大倍率为4小时，每隔30 秒点击这里观看视频