罗丹明-肌动蛋白标记F -肌动蛋白在通透的神经生长锥刺完
概要
描述的方法来可视化和量化，F -肌动蛋白在神经生长锥刺完。盖玻片上培养神经细胞后，细胞透用含皂甙的解决方案。然后，潜伏期短皂苷含有若丹明-肌动蛋白的缓冲区纳入到免费的肌动蛋白刺完肌动蛋白的荧光。
Abstract
轴突生长的能动的小技巧，被称为生长锥。生长锥导致导航轴突通过发展组织与当地表达的分子的指导线索，结合生长锥的受体和调节的动态和组织的生长锥细胞骨架3-6交互。这些导航信号的主要目标是肌动蛋白丝小梁，填补了生长锥外围和驱动器的增长，通过不断的肌动蛋白聚合和动态重构7锥蠕动。正或有吸引力的指导线索诱导生长锥转向通过刺激肌动蛋白丝（F – actin的）聚合在生长锥的外围接近源引诱提示地区。此肌动蛋白聚合驱动本地生长锥突领先的利润率和走向的诱食性轴索伸长率，附着力强。
肌动蛋白丝聚合取决于可用性和足够的肌动蛋白单体聚合单体此外细胞核或肌动蛋白丝刺结束。肌动蛋白单体是十分小鸡视网膜和背根神经节（DRG）生长锥。因此，聚合迅速增加F -肌动蛋白刺结束时成为单体此外的。出现这种情况通过当地的大义灭亲“F -肌动蛋白的蛋白质因子（ADF / cofilin）肌动蛋白解聚在生长锥地区接近一个引诱 8-10激活在鸡背根神经节和视网膜生长锥。这加剧ADF / cofilin活动中断微丝创造新的F -肌动蛋白聚合刺完。下面的方法演示了这种机制。 F -肌动蛋白总含量是荧光灯的鬼笔环肽染色观察。 F -肌动蛋白刺两端增长以下，这是适应从其他运动型细胞11，12以前的研究中所描述的程序透视锥细胞内的肌动蛋白罗丹明纳入可视化。当罗丹明-肌动蛋白浓度高于临界浓度的肌动蛋白单体除刺完补充说，罗丹明-肌动蛋白组装到免费的刺完。如果有吸引力的线索是在梯度，如被释放从定位到一个生长锥的一侧一个微量，纳入到F -肌动蛋白刺结 束罗丹明-肌动蛋白在生长锥端提高对微量10 。
生长锥，小巧精致的细胞结构。通透，罗丹明-肌动蛋白的法团，固定和荧光可视化的程序都用心去做，可在倒置显微镜阶段进行。这些方法可以适用于研究当地的肌动蛋白聚合中迁移神经元，其他基层组织细胞或细胞株。
Protocol
Discussion
这里介绍的方法允许在生长锥的迁移领先保证金，参与肌动蛋白细胞骨架的动态重塑的细胞成分的时间和空间分辨率。诱食分子，如神经生长因子或netrin，行动迅速刺激肌动蛋白丝聚合透露，作为在当地增加肌动蛋白刺完由肌动蛋白丝切断激活ADF / cofilin 10，如在图1和2所示。该方法允许介导生长锥chemotropic反应，如radixin，图，在图3和4的ERM蛋白，参与其他蛋白质的本地化。这些方法也可以…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢詹姆斯Bamburg博士和他在这些研究中的合作的实验室的成员。这项工作是由美国国立卫生研究院补助HD19950，EY07133从美国明尼苏达州医学基金会的资助。
Materials
| Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 18×18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | ||
| 35mm Petri dishes | Falcon | 351008 | ||
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | ||
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma | P1024 | ||
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | ||
| L1 CAM | R & D systems | 777-NC | ||
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen (Molecular Probes) | A22281 | ||
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | ||
| F12 Culture medium | Invitrogen (Gibco) | 21700-075 | ||
| B27 | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | ||
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
参考文献
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Letourneau, P., Squire, L. R. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. Encyclopedia of Neuroscience. , 1139-1145 (2008).
- Kalil, K., Dent, E. W. Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton. Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40, 209-227 (2003).
- Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. Actin-binding proteins take the reins in growth cones. Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).
- Guan, K. L., Rao, Y. Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).
- Gallo, G., Letourneau, P. C. Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues. J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).
- Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin. Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).
- Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. ADF/cofilin: A functional node in cell biology. Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).
- Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1. Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).
- Symons, M. H., Mitchison, T. J. Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts. J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).
- Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells. J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).
