Protocollo che descrive l'applicazione di un sistema di cella di flusso per la coltivazione e l'analisi biofilm microbici per la microscopia confocale a scansione laser (CLSM).
Cellule microbiche Molti hanno la capacità di formare comunità microbiche sessili definito come biofilm che hanno modificato le proprietà fisiologiche e patologiche rispetto ai microrganismi che vivono liberi. Biofilm in natura sono spesso difficili da indagare e di soggiornare in condizioni di scarsa definite 1. Utilizzando un substrato trasparente è possibile al dispositivo di un sistema in cui biofilm semplici possono essere esaminate in maniera non distruttiva in tempo reale: qui dimostriamo il montaggio e il funzionamento di un sistema di modello di flusso di cellule, per studi in vitro 3D dei biofilm microbici generando alta riproducibilità sotto ben definite condizioni di 2,3.
Il sistema è costituito da una cella di flusso che funge da camera di crescita per il biofilm. La cella di flusso è fornito con sostanze nutritive e ossigeno da una fiaschetta di media tramite una pompa peristaltica e medio speso è raccolto in un contenitore dei rifiuti. Questa costruzione del sistema di flusso consente un approvvigionamento continuo di sostanze nutritive e la somministrazione di antibiotici ad esempio, con il minimo disturbo delle cellule coltivate in camera di flusso. Inoltre, le condizioni di flusso all'interno della cella di flusso consentono studi di biofilm esposti a sollecitazioni di taglio. Una bolla cattura confini dispositivo di bolle d'aria dal tubo che altrimenti potrebbe disturbare la struttura di biofilm nella cella di flusso.
Il sistema di cella di flusso è compatibile con microscopio confocale a scansione laser (CLSM) e può quindi fornire informazioni molto dettagliate 3D sullo sviluppo biofilm microbici. Cellule del biofilm possono essere etichettati con sonde fluorescenti o proteine compatibile con l'analisi CLSM. Ciò consente la visualizzazione on-line e permette di indagine di nicchie nel biofilm via di sviluppo. Interrelazione microbica, indagine degli agenti antimicrobici o l'espressione di specifici geni, sono delle configurazioni molti sperimentale che può essere indagato nel sistema di cella di flusso.
Abbiamo dimostrato un sistema a celle di flusso che rappresenta un potente strumento nelle indagini biofilm. In combinazione con immagini 3D con la microscopia confocale, il sistema ha una gamma di vantaggi rispetto ad altri metodi di analisi dei biofilm microbici mediante tecniche microscopiche più tradizionali. Questo sistema permette la visualizzazione in 3D di comunità vive biofilm microbico senza disturbo della comunità. Microscopia ottica non fornirà informazioni dettagliate sulle nicchie del biofilm e, mentre la microscopia elettronica fornisce una risoluzione nanometrica del biofilm, non permette l'imaging dal vivo delle cellule.
Utilizzando il sistema descritto canale di flusso abbiamo già chiarito la distribuzione spaziale delle cellule batteriche sensibili ai diversi antibiotici 5-8 (Figura 4a), la distribuzione dei composti extracellulari, come ad esempio il DNA 9-11 e la distribuzione di cellule mobili e non mobili di la stessa specie all'interno di una comunità batterica 4,6,9 (Figura 4c). Prevediamo che il sistema di cella di flusso possono essere utilizzati per studiare gli aspetti di biofilm lievito. Questa potrebbe essere la distribuzione spazio temporale dei biofilm lievito in risposta a fattori ambientali come fungicidi così come l'identificazione di geni coinvolti nello sviluppo di lievito biofilm. Anche se il lievito non è noto a differenziarsi in cellule mobili e non mobili, altri aspetti di diversificazione biofilm possono essere studi come il cambiamento morfologico dal lievito alle cellule pseudohyphal e il passaggio da aploide a cellule diploidi.
Abbiamo dimostrato un sistema che rispettano diverse specie microbiche e lavorerà con tecniche di colorazione diverse. Una varietà di sonde di colorazione diversa e proteine fluorescenti, come GFP, consentono indagini specifica nicchia nel biofilm di sviluppo ed è uno strumento efficace per analizzare l'effetto degli agenti antimicrobici o di altri fattori ambientali. Le informazioni che si possono ottenere è molto dettagliata (Figura 4) e le caratteristiche nel biofilm può essere quantificato con programmi per computer come COMSTAT 12,13.
Nel complesso, l'aspetto più critico del protocollo è il fatto che si tratta di un processo che richiede tempo. E 'anche una limitazione che le cellule devono essere in grado di crescere in modo non fluorescente, superficie trasparente. . Dato che il biofilm formato viene analizzato con un microscopio confocale, la profondità che può essere indagato è limitata a qualche centinaio di micrometri 14 Ci sono ulteriori limitazioni tecniche inerenti alla progettazione: il sistema non è adatto per screening ad alto rendimento, come un ricercatore esperto in grado di gestire al massimo circa 15 canali per esperimento, che a sua volta può richiedere diversi giorni per prepararsi. Tuttavia, gli antibiotici o mutanti che sono considerati rilevanti per gli studi di biofilm può inizialmente essere messa a screening con altri metodi come macchie di cristallo viola prima che i candidati più interessanti sono trasferite al sistema di cella di flusso. Le lamiere di copertura in vetro sono molto sottili e si rompono facilmente, e si deve prestare attenzione durante la manipolazione del sistema. Inoltre i tubi dovrebbero essere esaminati ogni giorno durante la corsa di un esperimento, come una notevole "back-crescita" nei tubi di aspirazione a monte delle cellule flusso può verificarsi. Tale contaminazione può essere risolto rimuovendo diversi centimetri di tubo di silicone dal lato ingresso delle cellule di flusso, con tecnica sterile.
Figura 4 a) quattro giorni PAO1 vecchia -. Biofilm GFP trattati per 24 ore con colistina e ioduro di propidio per la colorazione morti (macchia rossa) b) presentazione in 3D di una tre giorni di vecchio P. PAO1 aeruginosa (P. aeruginosa tipo selvatico) – GFP biofilm 6 c) immagine di presentazione in 3D di un PAO1 – CFP pila mutante (blu) con un tipo di PAO1 YFP selvatico (giallo), d) 5 giorno di vita PAO1 – GFP biofilm presentato come un 3D e immagine) 26 h S. cerevisiae (PTR3 mutante in CEN.PK sfondo) biofilm colorate con Syto-9 15.
The authors have nothing to disclose.
Tubing:
Media
P. aeruginosa medium | |
A10 | g/L |
(NH4)2SO4 | 2.0 |
Na2HPO4 X 2H2O | 6.0 |
KH2PO4 | 3.0 |
NaCl | 3.0 |
Autoclave | |
FB | |
MgCl2 6H2O | 0.20 |
1 mL 1 M CaCl2 | 0.01 |
100 μL/L Trace metals (for P. aeruginosa-biofilms)4 | |
Autoclave | |
Mix A10 and FB in a ratio of 1:10. | |
Add carbon source to a desired concentration. |
S. cerevisiae synthetic complete (SC) medium | |
g/L | |
Adenine sulfate | 0.02 |
L-tryptophan | 0.02 |
L-histidine-HCL | 0.02 |
L-arginine-HCL | 0.04 |
L-methionine | 0.02 |
L-tyrosine | 0.05 |
L-leucine | 0.06 |
L-isoleucine | 0.06 |
L-lysine-HCL | 0.05 |
L-phenylalanine | 0.05 |
L-aspartic acid | 0.10 |
L-glutamic acid | 0.10 |
L-valine | 0.15 |
L-threonine | 0.20 |
L-serine | 0.40 |
Yeast Nitrogen base w/o amino acids and ammonium (Bacto) | 1.6 |
Ammonium sulphate | 5.0 |
NaOH | 6.0 |
Succinic acid | 10.0 |
Autoclave | |
Glucose (autoclaved separately) | 0.20 |