Utilizando imágenes bioluminiscentes encargado de investigar la sinergia entre Streptococcus pneumoniae Y el Virus de la Influenza en ratones lactantes

1. Preparación de archivo Infecciosas de bioluminiscente S. pneumoniae Inocular un tubo que contiene 10 ml McCartney Todd-Hewitt suplementado con 0,5% (w / v) de extracto de levadura y una pequeña porción de agar sangre con bioluminiscentes S. pneumoniae y crecer estáticamente a 37 ° C y la densidad óptica (600 nm) de 0,40-0,45. Lugar de la cultura en hielo durante 5 minutos para detener a las células en esta fase de crecimiento. A los 10 ml de S. mediados de registro de la fase de crecimiento pneumoniae añadir 1 ml de 80% (v / v) de glicerol y se mezcla, en la parte alícuota de los volúmenes deseados y almacenar a -70 ° C. Determinar la dosis infecciosa del S. bioluminiscentes pneumoniae stock de cuenta viable de diluciones seriadas en placas de agar sangre. 2. El crecimiento y la preparación de la influenza A reserva de virus Virus de la influenza se cultiva en el líquido alantoideo de 10 días de los huevos de gallina embrionados de edad. Descongelar un vial con virus de influenza A en 37 ° C baño de agua. Utilizando una fuente de luz colocada sobre la sacos aéreos (inspección visual), marca en la cáscara del huevo de la ubicación de la cámara de aire en un punto libre de las venas subyacentes. Desinfectar la superficie de los huevos de la limpieza con etanol al 70% y limpie con un trapo. Perforar un pequeño agujero en el saco de aire justo por encima de la marca con escribano de un joyero. Con los huevos colocados en una caja con la parte más alta del saco de aire, utilice una jeringa de 13 mm 1 ml y una aguja 26G inoculación de cada huevo a través del agujero en la capa con 0,1 ml de la influenza A virus convenientemente diluida. Punto de la aguja directamente hacia abajo en la cavidad alantoidea, perforando la sacos aéreos. Sellar el agujero con cera fundida y se incuban los huevos durante 2 días en un incubador humidificado de huevo a 35 º C. Después de 2 días de incubación, vela los huevos para comprobar la presencia de vasos sanguíneos para confirmar que el embrión está vivo. Si el huevo es de color negro en el interior, el embrión ha muerto y el huevo debe ser desechado y no se utilizan para la recolección de la influenza A virus. Coloque los huevos a 4 ° C durante la noche para matar a los embriones y la constricción de los vasos sanguíneos con el fin de minimizar la interrupción de los vasos, ya que el contacto entre la sangre y el virus se traduciría en la unión del virus a los glóbulos rojos. Al día siguiente, desinfectar la superficie de los huevos de la limpieza con etanol al 70%. Trabajar en un gabinete de bioseguridad clase II para recoger el líquido alantoideo que contenga el virus de influenza A de los huevos. Quite la cera y el uso de tijeras curvas para cortar en la parte superior del huevo para extraer la bolsa de aire por encima de la membrana alantoidea. Punción y despegue de la membrana alantoidea con una pinza estéril. Aspirar el líquido alantoideo con una pipeta de 10 ml estéril mientras se mantiene el embrión a un lado con otra pipeta estéril. Recoger el líquido alantoideo agrupados en 50 ml tubos y mantener en hielo en todo momento. Si el líquido alantoideo es sanguinolenta o contiene yema de no añadir a la piscina. Centrifugar el líquido alantoideo durante 5 minutos a 2.000 rpm a temperatura ambiente para eliminar los residuos. Alícuota del líquido alantoideo infeccioso en criotubos 1-2 ml y almacenar a -70 ° C. Determinar la influenza A título de virus del líquido alantoideo descongelado en 3 ensayos de placa realizaron de forma independiente en la formación de las células Madin-Darby de riñón canino (ver más abajo). Utilice una alícuota de nuevo tipo del virus para cada experimento. Repetidos de congelación-descongelación reducirá el título de infectividad. 3. Infección intranasal de ratones con bioluminiscentes S. pneumoniae y / o virus de influenza A Descongele stock de bioluminiscentes S. pneumoniae y diluir a dosis deseada en PBS. Suavemente recoger 5 ratones días de edad entre los dedos índice y pulgar y mantener en posición vertical. Use una pipeta para colocar bioluminiscentes S. pneumoniae en las fosas nasales en un volumen de 3μl. Espere hasta que todo el inóculo se inhala antes de colocar el ratón en la jaula. Use 3μl de PBS para la infección simulada. Tres a nueve días después de la colonización con S. bioluminiscentes pneumoniae, descongelar una alícuota de fluido alantoideo que contenga el virus de la gripe A y se diluye en PBS a la concentración deseada. Infectar a los ratones con el virus de influenza A en un volumen de 3μl PBS como se describe en el paso 3.2. Use 3μl de fluido alantoideo diluido a partir de huevos infectados por el virus de la maqueta infección. Vigilar el bienestar de los ratones al día, observando su apariencia, comportamiento, condición corporal y, en los ratones que son ≤ 3 días de edad, la presencia de manchas de leche. Una guía para los puntos finales humano y criterios de intervención debe ser desarrollado en consulta con el veterinario de los animales de laboratorio (Tabla 3). 4. Bioluminiscente de imágenes utilizando el espectro IVIS (Caliper Life Sciences) Prepare una mezcla de ketamina en 0,75 mg / ml y 1.76mg/ml xilazina en agua inyectable. Para anestesiar a los ratones, inyectar 100μl/10 g de peso corporal en peritonealcavidad. Coloque los ratones anestesiados en la caja de imagen. Debe prestarse cuidadosa atención a mantener a la región anatómica de interés en paralelo a la cámara cuando se coloca el ratón en el interior de la caja de imagen / cámara. Coloque la caja con los ratones en IVIS y permitir la entrada de isoflurano en la caja de 0,5 L / min para mantener la anestesia. Conjunto de la máquina IVIS para corregir plataforma de imágenes y hurgar en la basura y la captura de imágenes durante 7 minutos. Permita que los ratones a recuperarse de la anestesia en una caja caliente (por ejemplo, utilizando una almohadilla de calor) antes de regresar a casa jaula. Las imágenes son analizadas y ajustadas a la misma escala con la imagen viva de paquetes de software versión 3.0 (Caliper Life Sciences). Señales bioluminiscentes en una región seleccionada de interés se pueden cuantificar, ya sea como el flujo total (fotones / s) o la radiación promedio (fotones / s / cm 2 / sr). 5. Procesamiento de tejidos para determinar la carga bacteriana y el título de virus Los ratones son sacrificados por asfixia de CO 2 y la piel desinfectada con etanol al 70%. Inmovilizar al animal en una tabla de cortar duro. Usando una hoja de bisturí estéril, cortar por la mitad de la cabeza del animal, a partir posterior, y exponer la nasofaringe, doblando cada lado de la cabeza hacia el exterior. Obtener tejido nasofaríngeo de cada animal mediante el raspado del tejido de cada mitad de la cabeza con una pinza estéril y colocar en 1,5 ml de hielo frío RPMI. Mantener en hielo. Abrir la cavidad torácica con unas tijeras y retire los pulmones con una pinza estéril y tijeras. Enjuague los pulmones tres veces en PBS para eliminar la sangre y se acumulan en 1,5 ml de hielo frío RPMI. Mantener en hielo. Use un homogeneizador de homogeneizar los tejidos, volver a meterla en hielo. Quitar una parte alícuota del tejido homogeneizado y utilizarla para determinar la carga bacteriana. Prepare diluciones seriadas del homogeneizado de tejido y la placa de HBA. Placas de cultivo a 37 ° C durante 18-24 horas y determinar el conteo viable. Los títulos de bacterias en un órgano en particular, entonces se puede correlacionar con el número de fotones observados en la región. Centrifugar el resto del tejido homogeneizado a 3.500 rpm durante 10 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante y transferir a tubos limpios y estériles. Almacenar el sobrenadante a -70 ° C y determinar título viral por la placa de ensayo. 6. Placa de ensayo para determinar la influenza A título de virus en el tejido homogeneizado Los títulos de infectividad del virus están determinadas por la formación de placas en monocapas confluentes de riñón canino Madin-Darby (MDCK). Células MDCK son rutinariamente cultivadas en RF10 (Tabla 1) en botellas de cultivo de tejidos (Nunc) y se pasaron al confluente. Separar las células MDCK de las botellas de cultivo de tejidos utilizando tripsina. Lavar las células en RF10 y recoger las células por centrifugación a 1200 rpm durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en pellets RF10. Contar las células MDCK utilizando un hemocitómetro y colorante vital. Semillas de cada una de 35 mm y de placas de 6 pocillos (Nunc) con 1.2×10 6 células MDCK en 3 ml RF10 y cultivo de las células a 37 ° C CO 2 y el 5% para alcanzar la confluencia (en ~ 24 horas). Prepare Leibovitz dsL15 los medios de comunicación y el 1,8% (w / v) de agarosa superposición de los medios de comunicación (Tabla 1). Alícuota dsL15 los medios de comunicación y el 1,8% (w / v) de agarosa en 50 ml en frascos estériles. Mantenga dsL15 los medios de comunicación a 4 ° C hasta su uso y agarosa a 56 ° C hasta su uso. Compruebe que las monocapas de células MDCK son confluentes y se lavan las células con RPMI + aspirando el RF10 y su sustitución por ~ 1,5 ml de RPMI +. En ningún momento del procedimiento en caso de placas de permitir que se seque por completo. Las placas se incuban a 37 ° C hasta el momento de añadir las muestras que contienen virus. Prepare diluciones seriadas de las muestras de virus en RPMI +. Mantener las muestras en hielo hasta su uso. Aspirar RPMI + a partir de las monocapas y añadir 135uL RPMI + de diluciones adecuadas de muestra de virus a cada pocillo. Analice cada muestra por duplicado. Se incuban las células MDCK con las muestras de virus durante 45 min a 37 ° C y CO 2 al 5%. Agite suavemente las placas cada 15 minutos para distribuir uniformemente el virus y evitar la resequedad de las monocapas de células MDCK. Mueva la agarosa de 56 ° C a 46 ° C baño de agua caliente y dsL15 medios de comunicación a 46 ° C en baño de agua. 45 minutos después de la incubación del virus en las monocapas de MDCK, tomar placas de 5% de CO 2 incubadora. Quitar de agarosa y los medios de comunicación L15 de 46 ° C baño de agua. Añadir 0,2 ml de tripsina al 0,1% a 50 ml de dsL15 medios de comunicación, que añade 50 ml de dsL15 + tripsina a 50 ml de 1,8% (w / v) de agarosa. Mezcla la agarosa y L15 suavemente y agregar 3 ml de medio de recubrimiento a cada pocillo de las placas de 6 pocillos. Agitar suavemente para asegurar la monocapa de células MDCK todo está cubierto. Una vez que la plantilla se ajusta placas se incuban a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 2-4 días. Al final del período de incubación, cuente el número de placas como una medida de virus infectividad. Si es necesario, las placas pueden ser visualizados por tinción de las monocapas con cristal violeta en metanol. 7. Sección C – Los secretos del éxito: 1 Todos los trabajos experimentales con S. pneumoniae (por ejemplo, la inoculación de cultivos líquidos, el tratamiento de los tejidos de los ratones infectados con S. pneumoniae) se lleva a cabo en un gabinete de bioseguridad clase II. 1.1 Creamos bioluminiscentes S. pneumoniae cepas mediante la introducción de plásmidos pPJTG28 3. Sin embargo, una gran variedad de diferentes S. bioluminiscentes cepas de neumococo están disponibles 4.6. Bioluminiscentes S. cepas de S. pneumoniae también puede ser comprado de Caliper Sciences Inc Vida (MA, EE.UU.). 1.1 Cinética de crecimiento de varios S. cepas de neumococo pueden variar y deben ser determinadas para cada cepa. Puede tomar de 3 a 4 horas para llegar a OD600nm = 0,4 a 0,45. 1.4 Por lo general se esperaría que el infecciosas acciones para alcanzar la concentración de 10e8 UFC / ml y recomendar una serie de diluciones a partir de 10e-10e-4 a 8 para determinar la concentración de bacterias viables. 2.6 El título apropiado a utilizar para la inoculación de los huevos, depende de la cepa del virus utilizado y pueden ir desde 10e-10e-3 a 5. Cepas del virus gripal obtenidos a partir de sobrenadantes de cultivo de tejidos puede ser a veces utiliza en estado puro. 3.2a Habitualmente usamos 2.000 UFC de S. pneumoniae cepa EF3030 para colonizar 5 ratones días de edad 3. La dosis exacta infecciosas del inóculo se determina a posteriori para cada experimento en placas diluciones seriadas del inóculo en placas de agar sangre de caballo. La capacidad de la S. pneumoniae cepa de colonizar los ratones se determinó en primer lugar por el número viable de tejido homogeneizado (nasofaringe por ejemplo, los pulmones) en diversos puntos temporales después de la inoculación de los ratones. 3.2b No es necesario el uso de anaestetics para administrar la bacteria o virus a los animales a través de la inhalación. Ratones jóvenes (al igual que los ratones adultos) debe ser inmovilizado con las manos y en posición vertical por el investigador, el inóculo (3 microlitros de ratones lactantes, de hasta 10 microlitros de ratones adultos) entonces se cae en las fosas nasales y la inhalación de todos los del inóculo es confirmado por la observación. 3.2c quitar los ratones recién nacidos, uno por uno del nido y se inoculan con bacterias o virus, según sea necesario. Marque la cola del animal usando un marcador permanente si el animal es necesario y volver a la jaula de inmediato. Frote el animal con algún material de la cama para que la presa va a aceptar a los cachorros de nuevo en el nido. Nota: el marcador permanente se contagia a los animales de manera rápida y se debe volver a aplicarse cada día. Por otra parte, un sistema de tatuaje puede ser utilizada para identificar animales individuales. 3.3 Usamos 20 PFU virus de influenza A Udorn/307/72 (H3N2) para infectar a los ratones 8 a 14 días de edad 3. La mortalidad y morbilidad observadas en los animales que dependen de la cepa de S. pneumoniae y el virus de la influenza utilizado. La Tabla 3 proporciona un útil conjunto de criterios de valoración y criterios de intervención humana para su uso en los ratones más jóvenes de los 21 días de edad. Por lo general no se detecta ninguna mortalidad o la morbilidad cuando se utiliza S. pneumoniae EF3030 y una cepa del virus de la gripe Udorn/307/72 (H3N2), cuando los ratones son> 10 días de edad. 4.2 Para ser exactos, los ratones pueden ser pesados ​​antes de la inyección de la solución anestésica. Como una guía, unos 50-75 microlitros de solución de anestesia se utiliza durante 20 días los ratones viejos. El ratón es totalmente anestesiado cuando no responden a un pellizco en la cola o las extremidades posteriores. Mientras que en el IVIS, los ratones también estarán expuestos a isoflurano que se sumará la anestesia. El momento de la imagen después de la infección de los ratones depende de la cepa (s) de S. pneumoniae y el virus de la influenza utilizados, así como en los síntomas de interés. Realización de una pocas experiencias piloto para optimizar el tiempo de bioluminiscente de imágenes puede ser necesario. 4.3 Los ratones pueden ser colocados en una caja de aislamiento (que evita que los contaminantes que entran o salen de la caja) o, alternativamente, se puede colocar directamente en el instrumento para la imagen. Usamos la caja de aislamiento para los experimentos con ratones lactantes, con el fin de garantizar que los ratones siguen siendo anestesiado durante la elaboración y para evitar la contaminación del IVIS con S. pneumoniae y / o virus de la influenza. 4.3 Usar una imagen ventral de los ratones para obtener una imagen de las vías respiratorias. Una imagen lateral del ratón proporciona una imagen más sensible de las orejas. 4.4 Cuando los ratones se colocan directamente en la cámara, el isoflurano es entregado a los ratones a través de los conos de ojiva. Para los experimentos en los que se utilizan ratones lactantes, la caja de aislamiento es preferible ya que los conos de nariz no caben en ratones lactantes. 4,5 Tque el tiempo de exposición total que se necesita para capturar una imagen puede variar entre los experimentos de acuerdo con la intensidad de la señal bioluminiscente, la ubicación de la señal, la cepa bacteriana y se utiliza la cepa de ratón. Respecto a esto último, tanto el pigmento y la piel de manera significativa puede atenuar la señal detectable total. La cámara en el espectro IVIS es una copia de diluir, de nuevo iluminado CCD ofrece una amplia gama dinámica (65536 niveles de gris). Lo ideal sería que el tiempo de exposición se debe establecer en la captura de entre 60 y 60.000 cuentas. En nuestra experiencia con los ratones C57BL / 6, el aumento de la imagen en tiempo más de 7 minutos, no se mejoran notablemente la relación señal-ruido. Opciones alternativas para aumentar la señal bioluminiscentes incluyen el aumento del grado de hurgar en la basura (es decir, a los grandes) y el uso de un campo más pequeño de vista. Es importante destacar que la cuantificación no se debe realizar en las áreas dentro de la imagen contiene píxeles saturados, ya que esto proporciona un valor subestimado el número de fotones detectados. Si no está seguro en cuanto a las condiciones óptimas, la función de auto-exposición puede ser utilizado como una guía. 4.5 En caso de una fuerte señal bioluminiscente en una parte del ratón está obstruyendo la detección de la bioluminiscencia en una región cercana, regiones seleccionadas del ratón se puede cubrir con papel negro y las imágenes pueden proceder de forma normal 4.7 Si la señal luminosa se cuantifica en forma de fotones (en lugar de cuentas) variaciones en las condiciones de imagen (imágenes en tiempo, por ejemplo) entre los experimentos no afectará a la medición de la señal bioluminiscente. 4.8 Si se utiliza el flujo total para medir los fotones en una región determinada, asegúrese de que la misma "zona de interés 'forma se utiliza para todas las muestras. Los ratones 5.1a puede ser sacrificado en ningún momento después de la infección con virus de influenza A, dependiendo del interés del investigador. Por lo general determinan título de bacterias y virus a los 6 días después de la infección con virus de influenza A Udorn/307/72 (H3N2) y no se observó ninguna mortalidad / morbilidad. Sin embargo, la morbilidad y la mortalidad observada en estos experimentos pueden variar dependiendo de la S. pneumoniae y se utiliza una cepa del virus de la gripe y el punto en el tiempo chosed debe tener tasas de mortalidad y morbilidad en cuenta para minimizar el impacto sobre el bienestar animal. La Tabla 3 proporciona una guía útil para los criterios de intervención y criterios de valoración humana para su uso en estos experimentos. En general, los ratones son sacrificados y los tejidos procesados ​​como se describe a menos de 3 horas después en vivo bioluminiscente de imágenes. 5.1b Los ratones menores de 10 días de edad son resistentes a la hipoxia y son sacrificados por decapitación. En la configuración descrita experimental, los ratones son por lo menos 14 días de edad y pueden ser sacrificados por asfixia de CO 2. 5.7 agar sangre placas pueden ser complementados con 5μg/ml gentamicina para evitar el crecimiento de las bacterias comensales en los homogeneizados de los tejidos nasales. El rango de diluciones dependerá de la S. pneumoniae cepa utilizada. Para los experimentos en ratones 20 días de edad con S. pneumoniae cepa EF3030, se utiliza puro, 10e-1, 10e-10e 2 y 3. 5.8 Tienda de cada muestra de tejido homogeneizado en al menos dos alícuotas, de modo que una muestra de respaldo se encuentra disponible en caso de que el ensayo de placa virus no! Un título viral precisa sólo puede ser obtenida de una muestra, una vez descongelado tras su congelación, pero no a partir de muestras repetidas de congelación y descongelación. 6.1 Cuando se cultiva el 90-100% confluentes, un solo 150cm 2 frasco de cultivo de tejidos producirá suficientes células MDCK por cinco placas de 6 pocillos. 6.5 La serie de dilución óptima dependerá de la cepa del virus utilizado y el tiempo después de la infección. Por lo general, podemos utilizar puro, 10e-10e 1 y 2 diluciones de los homogeneizados de órganos tomadas seis días después de la infección con el virus de la influenza. 6.6 El uso de diluciones seriadas de stock de virus es un control, positivas para el uso en cada placa de ensayo. Como control negativo, RPMI + se pueden utilizar. 8. Los resultados representativos: Figura 1. Esquema de huevos embrionados de pollo. Figura 2. BLI de S. pneumoniae infectados ratón en los días 3 y 4 después de la infección con el virus de la influenza se burlan. Figura 3. BLI de S. virus de la influenza pneumoniae y co-infectados del ratón en los días 3 y 4 después de la infección con el virus de la influenza. Figura 4. Carga bacteriana en la nariz de un único y una co-infecciónTed ratón. Figura 5. Títulos viral en la nariz y los pulmones de un ratón co-infectados. Medios de comunicación Contenido 1,8% (w / v) de agarosa Añadir 0,9 g de agarosa a 50 ml de H2O destilada, esterilizar en autoclave a 121 ° C durante 10 minutos. Transferencia a 56 ° C baño de agua para enfriar. L15 Doble Leibovitz fuerza a medio (ds L15) 1 bolsa de polvo L15 (para compensar 1L) se disuelve en 450 ml agua destilada estéril H 2 O y se agita hasta que se disuelva. El pH se ajusta a pH 6,8 con HCl 1M. Luego complementar con 4 ml de 7% (w / v) NaHCO3, 0,4 ml de HEPES (pH 0,5, 6,8), 200 U / ml de penicilina, 200 mg / ml de estreptomicina, 60 mg / ml de gentamicina. Ajustar el volumen final de 500 ml y el filtro de esterilización. Agar sangre de caballos (HBA) 4% de HBA (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido), dH 2 O, 7% (v / v) de sangre de caballo RF10 RPMI-1640 con glutamina 2 mM, piruvato de sodio 2 nm, 24 mg / ml de gentamicina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 10% (v / v) inactivado por calor suero fetal bovino. RPMI + RPMI-1640 con glutamina 2 mM, piruvato de sodio 2 nm, 24 mg / ml de gentamicina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina Todd-Hewitt + 0,5% de extracto de levadura Todd Hewitt (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) en dH 2 O complementado con un 2% (w / v) de extracto de levadura Tabla 1. Medios específicos utilizados en este protocolo. Nombre del Material Tipo Empresa Número de catálogo Comentario Medio RPMI 1640 Reactivo Gibco 21870-076 Tripsina Reactivo Worthington Biochemical Corp. LS003740 TPCK tratada L-15 de Leibovitz medio Reactivo Gibco 41300-039 Agarosa, tipo I Reactivo Sigma-Aldrich A6013 Use la temperatura de fusión baja de agarosa, como SeaPlaque agarosa Madin-Darby de células de riñón canino Reactivo ATCC CCL-34 Tabla 2 reactivos y equipos específicos.: Efecto sobre el bienestar animal Leves a moderados signos una B signos graves No específica signo (s): Apariencia De ligera a moderada piloerección sin deshidratación (persistencia del pliegue cutáneo) Piloerección, con la deshidratación (persistencia del pliegue cutáneo) Condición Corporal reducción del peso de ganancia No hay aumento de peso o reducción en el peso Comportamiento Suave pero sensible, disminución de la interacción con sus compañeros. Que no responden a la actividad y la provocación. Aislado de otros compañeros de camada Condiciones específicas o de firmar anormales clínicos (s): La ausencia de la mancha de leche (<2-3 días de edad) Trata de animar a la succión, si esto se ha observado durante <24 horas. Si no hay evidencia de la mancha de leche, incluso con el aliento después de 24-48h, o si, obviamente, no ha amamantado, considerar la eutanasia. Otros signos Busque Estabulario Manager / Animales de Laboratorio Veterinario re consejo: las medidas adecuadas o la eutanasia si el animal está en el dolor moderado o severo o sufrimiento Tabla 3. Criterios de intervención para los ratones lactantes (<21 días): Cuando uno a uno o más "leve a moderada" se observan signos de aumento de frecuencia de las observaciones de dos veces al día y buscar el asesoramiento de oficial de protección de los animales en su caso, lo que puede ser que el tratamiento y la atención prestada. b Cuando uno o más "grave" se observan signos, la eutanasia a los ratones conmétodo apropiado. Ratones <10 días de edad son sacrificados por decapitación, los ratones> 10 días de edad son sacrificados por asfixia de CO 2.