Utilizzando Imaging Bioluminescent per Indagare il sinergismo tra Streptococcus pneumoniae E Influenza A virus in topi neonati

1. Preparazione di Stock Infettive di Bioluminescent S. pneumoniae Inoculare una provetta contenente 10 ml McCartney Todd-Hewitt brodo integrato con 0,5% (w / v) estratto di lievito e un pezzetto di agar sangue con bioluminescenti S. pneumoniae e crescere staticamente a 37 ° C e densità ottica (600 nm) di 0,40-0,45. Posizionare la cultura in ghiaccio umido per 5 minuti per arrestare le cellule in questa fase di crescita. Per i 10 ml di mid-log fase di crescita S. pneumoniae aggiungere 1 ml di 80% (v / v) glicerolo e mescolare, aliquotare in i volumi desiderati e conservare a -70 ° C. Determinare la dose infettiva della S. bioluminescenti magazzino pneumoniae dal conte vitali di diluizioni seriali su piastre di agar sangue. 2. Crescita e la preparazione di influenza A magazzino virus Influenza A virus è coltivato in liquido allantoico di uova vecchie di 10 giorni embrionate di pollo. Scongelare una fiala da virus dell'influenza A nel 37 ° C bagnomaria. Utilizzando una fonte di luce posta sopra la (speratura) airsac, segno sul guscio la posizione del sacco aereo in un punto privo di venature sottostanti. Disinfettare la superficie delle uova strofinando con etanolo al 70% e pulire. Pierce un piccolo foro nel sacco aria appena sopra il marchio con scriba una gioielleria. Con le uova posizionato in una scatola con il più alto d'aria sacco, utilizzare una siringa 13 millimetri 1 ml e un ago 26G per inoculare ogni uovo attraverso il foro nella conchiglia con 0,1 ml di influenza da virus A opportunamente diluita. Il punto direttamente verso il basso l'ago nella cavità allantoidea, perforando la airsac. Sigillare il foro con cera fusa e incubare le uova per 2 giorni in un uovo incubatore umidificato a 35 ° C. Dopo 2 giorni di incubazione, le uova candela per verificare la presenza di vasi sanguigni per confermare l'embrione è ancora vivo. Se l'uovo è nero dentro, l'embrione è morto e l'uovo deve essere eliminata e non utilizzati per la raccolta del virus. Mettere le uova a 4 ° C durante la notte per uccidere gli embrioni e la costrizione dei vasi sanguigni in modo da minimizzare l'interruzione dei vasi, come il contatto tra il sangue e virus comporterebbe legame del virus ai globuli rossi. Il giorno dopo, disinfettare la superficie delle uova strofinando con etanolo al 70%. Lavoro in classe II biosicurezza Gabinetto per raccogliere il liquido allantoideo contenente il virus dalle uova. Rimuovere la cera e usare le forbici per tagliare curve intorno alla parte superiore dell'uovo per rimuovere la sacca d'aria al di sopra della membrana allantoide. Puntura e togliere la membrana allantoide con pinza sterile. Aspirare il liquido allantoico con una pipetta 10 ml sterile mentre si tiene l'embrione di un lato con un'altra pipetta sterile. Raccogliere pool liquido allantoico in 50mL tubi e tenere in ghiaccio in ogni momento. Se il liquido allantoico è cruenta o contiene tuorlo non aggiungere alla piscina. Centrifuga liquido allantoico per 5 min a 2.000 giri al minuto a temperatura ambiente per rimuovere i detriti. Aliquota del fluido infettive allantoideo in 1-2 cryotubes ml e conservare a -70 ° C. Determinare il virus influenzale A titolo del liquido scongelato allantoideo in 3 test placca condotta separatamente formando in Madin-Darby cellule renali canine (vedi sotto). Utilizzare una nuova aliquota di virus per ogni esperimento. Ripetuti di congelamento-scongelamento ridurrà il titolo infettante. 3. Infezione intranasale di topi con bioluminescenti S. pneumoniae e / o virus influenzale A Scongelare congelate di S. bioluminescenti pneumoniae e portare a dose desiderata in PBS. Delicatamente raccogliere 5 topi giorno di vita tra indice e pollice e tenere in posizione verticale. Utilizzare una pipetta ad abbandonare bioluminescenti S. pneumoniae su narici in un volume di 3μl. Attendere che tutte dell'inoculo viene inalato prima di mettere il mouse di nuovo nella gabbia. L'uso 3μl di PBS per l'infezione in giro. Da tre a nove giorni dopo la colonizzazione con bioluminescenti S. pneumoniae, disgelo un'aliquota di liquido allantoico contenente virus influenzale A e diluire in PBS alla concentrazione desiderata. Infettare i topi da virus dell'influenza A in un volume di 3μl PBS come descritto al punto 3.2. L'uso 3μl di liquido allantoico diluito da uova infette per mock-infezione da virus. Monitorare il benessere dei topi quotidianamente osservando il loro aspetto, comportamento, condizione fisica e, nei topi che sono ≤ 3 giorni di età, la presenza di macchie latte. Una guida per i punti finali umano e criteri di intervento devono essere sviluppati in consultazione con il veterinario per animali da laboratorio (Tabella 3). 4. Bioluminescenti immagine che utilizzano lo spettro IVIS (Caliper Life Sciences) Preparare una miscela di ketamina a 0,75 mg / ml e xilazina 1.76mg/ml in acqua iniettabile. Per anestetizzare topi, iniettare 100μl/10 g di peso corporeo in peritonealecavità. Luogo topi anestetizzati nella casella di imaging. Particolare attenzione deve essere rivolta a tenere la regione anatomica di interesse parallelo alla fotocamera quando si posiziona il mouse all'interno della finestra di imaging / camera. Box posto con i topi in IVIS e consentono l'ingresso isoflurano nel box a 0,5 L / min per mantenere l'anestesia. Set macchina IVIS per correggere piattaforma di imaging e di binning e cattura di immagini per 7 minuti. Lasciare i topi per recuperare da anestesia in una scatola riscaldata (ad esempio utilizzando un tappetino di calore) prima di tornare a casa gabbia. Le immagini sono analizzate e adeguate alla stessa scala utilizzando il Living Immagine pacchetto software versione 3.0 (Caliper Life Sciences). Segnali bioluminescenti in una regione di interesse selezionati può essere quantificata come sia il flusso totale (fotoni / s) o la radianza media (fotoni / s / cm 2 / sr). 5. Lavorazione di tessuti per determinare il carico di batteri e virus titolo I topi vengono soppressi asfissia da CO 2 e la pelliccia disinfettati con etanolo al 70%. Immobilizzare l'animale su un tagliere duro. Utilizzando una lama bisturi sterile, tagliare il centro della testa dell'animale, a partire posteriore, ed esporre la nasofaringe piegando ogni lato della testa verso l'esterno. Raccogliere il tessuto nasofaringeo di ogni animale raschiando il tessuto di ogni metà della testa con pinza sterile e posto in 1,5 ml ghiacciata RPMI. Tenere su ghiaccio. Aprire la cavità toracica con le forbici e togliere i polmoni con pinza sterile e forbici. Sciacquare i polmoni tre volte in PBS per rimuovere ogni traccia di sangue e raccogliere in 1,5 ml ghiacciata RPMI. Tenere su ghiaccio. Utilizzare un omogeneizzatore ad omogeneizzare i tessuti, posto di nuovo sul ghiaccio. Rimuovere una aliquota del tessuto omogeneizzato e utilizzare questo per determinare la carica batterica. Preparare diluizioni seriali del tessuto omogenato e la piastra su HBA. Piastre di coltura a 37 ° C per 18-24 ore e determinare numero di organismi vitali. I titoli batterica in un particolare organo può essere correlata con il numero di fotoni osservata in quella regione. Centrifugare il resto del tessuto omogeneizzato a 3.500 giri per 10 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e trasferire da pulire, provette sterili. Conservare il surnatante a -70 ° C e determinare titolo virale mediante test placca. 6. Placca test per determinare l'influenza A titolo virus in omogenati di tessuti I titoli infettività del virus sono determinate dalla formazione di placca su monostrati confluenti di Madin-Darby rene canino (MDCK). MDCK cellule sono normalmente coltivate in RF10 (Tabella 1) in bottiglie di coltura tissutale (Nunc) e diversi passaggi quando confluenti. Staccare le cellule MDCK dalle bottiglie di coltura di tessuti utilizzando tripsina. Lavare le cellule in RF10 e raccogliere le cellule per centrifugazione a 1200 rpm per 5 min. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule pellet in RF10. Contare le cellule MDCK utilizzando un emocitometro e colorante vitale. Seme di ogni ben 35 millimetri di 6-pozzetti (Nunc) con 1.2×10 6 celle MDCK in 3ml RF10 e coltivare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per raggiungere confluenza (in ~ 24 ore). Preparare Leibovitz dsL15 media e 1,8% (w / v) agarosio sovrapposizione media (Tabella 1). DsL15 aliquota media e 1,8% (w / v) agarosio in 50mL in bottiglia sterile. Tenere dsL15 mezzi a 4 ° C fino all'utilizzo e agarosio a 56 ° C fino al momento dell'uso. Controllare che il monostrati cellulari MDCK sono confluenti e lavare le cellule con RPMI + aspirando il RF10 e la sua sostituzione con ~ 1,5 ml RPMI +. In nessuna fase della procedura in caso di piastre di essere lasciato asciugare completamente. Incubare le piastre a 37 ° C fino al momento di aggiungere i campioni contenenti virus. Preparare diluizioni seriali dei campioni di virus in RPMI +. Conservare i campioni in ghiaccio fino al momento dell'uso. Aspirare RPMI + dal monostrati e aggiungere 135uL RPMI + di opportune diluizioni di campione virus in ciascun pozzetto. Prova di ciascun campione in duplicato. Incubare le cellule MDCK con i campioni di virus per 45 minuti a 37 ° C e 5% di CO 2. Agitare delicatamente le piastre ogni 15 minuti per distribuire uniformemente il virus e impedire l'essiccazione dei monostrati cellulari MDCK. Spostare il agarosio da 56 ° C a 46 ° C a bagno-maria e caldo dsL15 media a 46 ° C a bagnomaria. Dopo 45 min di incubazione del virus sul monostrati MDCK, prendere piatti di 5% CO 2 incubatore. Rimuovere agarosio e L15 media da 46 ° C a bagno-maria. Aggiungere 0,2 ml di tripsina 0,1% a 50mL di dsL15 media, che aggiungere 50mL di dsL15 + tripsina a 50mL del 1,8% (w / v) agarosio. Mescolare l'agarosio e L15 delicatamente e aggiungere 3 ml di mezzo di copertura per ciascun pozzetto della 6-pozzetti. Agitare delicatamente per assicurare il monostrato intera cellula MDCK è coperto. Una volta che la sovrapposizione è impostato incubare le piastre a 37 ° C e 5% di CO 2 per 2-4 giorni. Al termine del periodo di incubazione, contare il numero di placche come misura di virus infectiviTy. Se necessario, le placche possono essere visualizzati dalla colorazione della monostrati con cristalvioletto disciolto in metanolo. 7. Sezione C – I segreti del successo: 1 Tutti i lavori sperimentali con S. pneumoniae (per esempio inoculazione di colture liquide, lavorazione di tessuti di topi infettati con S. pneumoniae) viene eseguito in una classe II biosicurezza Gabinetto. 1,1 Creiamo bioluminescenti S. ceppi pneumoniae con l'introduzione di plasmide pPJTG28 3. Tuttavia, una grande varietà di differenti bioluminescenti S. ceppi pneumoniae sono disponibili 4-6. Bioluminescenti S. ceppi pneumoniae possono essere acquistati anche da Caliper Life Sciences Inc (MA, USA). 1,1 cinetica di crescita dei vari S. ceppi pneumoniae possono variare e devono essere determinati per ogni ceppo. Si può richiedere da 3 a 4 ore per raggiungere OD600nm = 0.4 a 0.45. 1,4 Ci si aspetterebbe le scorte infettive per raggiungere la concentrazione di 10e8 UFC / ml e raccomandare una vasta contaminazione di 10e-10e-4 a 8 per determinare la concentrazione di batteri vitali. 2.6 Il titolo appropriato da utilizzare per inoculare le uova, dipende dal ceppo virale utilizzato e può variare da 3 a 10e-10e-5. Influenza A ceppi virali ottenuti da colture di tessuti surnatanti a volte può essere usato puro. 3.2a Noi abitualmente uso 2.000 CFU di S. pneumoniae ceppo EF3030 a colonizzare 5 topi giorno di vita 3. La dose infettiva precisa dell'inoculo viene determinato retroattivamente per ogni esperimento di placcatura diluizioni seriali dell'inoculo su piastre di agar sangue di cavallo. La capacità del S. pneumoniae ceppo di colonizzare topi è determinato in primo luogo dal conte vitali di omogenati di tessuti (es. nasofaringe, polmoni) in diversi momenti dopo l'inoculazione dei topi. 3.2b Non è necessario usare anaestetics per amministrare i batteri o virus agli animali per inalazione. Topi neonati (così come topi adulti) dovrebbe essere trattenuto a mano e tenuta in piedi dallo sperimentatore, l'inoculo (3 microlitri per i topi neonati, fino a 10 microlitri per topi adulti) viene poi lasciato cadere sul narici e l'inalazione di tutte le inoculo è confermata dalle osservazioni. 3.2c Rimuovere topo neonato uno per uno dal nido e inoculare con batteri o virus, se necessario. Segna la coda dell'animale utilizzando un pennarello indelebile se l'animale necessario e tornare alla gabbia immediatamente. Strofinare l'animale con alcuni lettiera in modo che la diga accetterà i cuccioli di nuovo nel nido. Nota: pennarello indelebile si stacca gli animali rapidamente e deve essere nuovamente applicata ogni giorno. In alternativa, un sistema di tatuaggio può essere utilizzato per identificare i singoli animali. 3,3 Utilizziamo 20 PFU virus Udorn/307/72 (H3N2) per infettare 8-14 topi giorno di vita 3. Mortalità e morbilità osservato negli animali dipende dal ceppo di S. pneumoniae e virus usati. La tabella 3 fornisce una serie utile di end point umano e criteri di intervento da utilizzare nei topi di età inferiore ai 21 giorni di età. Noi in genere non rilevare eventuali mortalità e sulla morbilità durante l'utilizzo S. pneumoniae EF3030 e virus ceppo Udorn/307/72 (H3N2) quando i topi sono> 10 giorni. 4.2 Per essere precisi, i topi possono essere pesati prima iniezione della soluzione anestetica. Come guida, circa 50-75 microlitri di soluzione anestetica viene utilizzato per 20 giorni topi vecchi. Il mouse è completamente anestetizzato quando non rispondono ad un pizzico in coda o degli arti posteriori. Mentre nel IVIS, i topi saranno anche esposti a isoflurano che andrà ad aggiungersi l'anestesia. I tempi di imaging dopo l'infezione dei topi dipende dal ceppo (s) di S. pneumoniae e virus usati come pure sui sintomi di interesse. Esecuzione di un paio di esperimenti pilota per ottimizzare i tempi di bioluminescente immagini può essere necessario. 4,3 I topi possono essere inseriti in una cassetta di isolamento (che impedisce ai contaminanti di entrare o uscire dalla scatola) o, in alternativa, può essere collocato direttamente nello strumento per l'imaging. Usiamo il box di isolamento per gli esperimenti con i topi neonati, al fine di garantire i topi rimangono anestetizzato durante la procedura di imaging e per evitare la contaminazione del IVIS con S. pneumoniae e / o virus. 4.3 Utilizzo un'immagine ventrale del mouse per ottenere un'immagine delle vie respiratorie. Un'immagine laterale del mouse fornisce un'immagine più sensibile delle orecchie. 4.4 Quando i topi sono posizionati direttamente nella camera, isoflurano è consegnato ai topi tramite coni naso. Per gli esperimenti in cui sono utilizzati topi neonati, la casella di isolamento è preferibile in quanto i coni naso non entrano in topi neonati. 4,5 Tha tempo di esposizione totale necessario per catturare un'immagine può variare tra esperimenti secondo la forza del segnale bioluminescente, la posizione del ceppo segnale, batteriche e il ceppo di topi utilizzato. Per quanto riguarda questi ultimi, e di pigmentazione pelliccia può attenuare in modo significativo il segnale totale rilevabile. La fotocamera sul Spectrum IVIS è un back-assottigliato, retroilluminato CCD che offre una vasta gamma dinamica (65536 livelli di grigio). Idealmente, il tempo di esposizione deve essere impostato per catturare tra 60 e 60.000 punti. Nella nostra esperienza con C57BL / 6 topi, aumentando il tempo di imaging oltre 7 minuti non marcatamente migliorare il rapporto segnale-rumore. Opzioni alternative per aumentare il segnale bioluminescente includono l'aumento del grado di binning (cioè alle grandi) e con un campo più piccolo di vista. È importante sottolineare che la quantificazione non deve essere eseguita su aree all'interno dell'immagine che contiene pixel saturi, in quanto ciò fornisce un valore sottostimato per il numero di fotoni rilevati. Se non siete sicuri riguardo alle condizioni ottimali, l'auto-esposizione funzione può essere utilizzata come linea guida. 4.5 Se un segnale forte bioluminescente in una parte del mouse è ostacolare il rilevamento di bioluminescenza in una regione vicina, regioni selezionate del mouse può essere coperto con carta nera e imaging può procedere come al solito 4,7 Se il segnale luminescente è quantificato in fotoni (al contrario di conteggi) variazioni delle condizioni di imaging (imaging in tempo ad esempio) tra esperimenti non influenzerà la misurazione del segnale bioluminescente. 4,8 Se si utilizza il flusso totale per misurare i fotoni in una regione determinata, in modo che lo stesso 'regione di interesse' forma è utilizzato per tutti i campioni. I topi 5.1a può essere eutanasia in qualsiasi momento dopo momento l'infezione da virus dell'influenza A, a seconda interesse del ricercatore. Noi normalmente determinano titolo batteriche e virali a 6 giorni dopo l'infezione con virus influenzale Udorn/307/72 A (H3N2) e non osservare alcuna mortalità / morbilità. Tuttavia, la morbilità e la mortalità osservata in questi esperimenti può variare a seconda della S.pneumoniae e ceppo di virus influenzale A utilizzati e il punto di tempo voi scelta dovrebbe prendere la mortalità e morbilità in considerazione per minimizzare l'impatto sul benessere degli animali. La tabella 3 fornisce una guida utile a criteri di intervento e gli endpoint umano per l'impiego in questi esperimenti. In genere, i topi sono eutanasia e tessuti trattati come descritto entro 3 ore dopo l'imaging in vivo bioluminescenti. 5.1b topi di età inferiore ai 10 giorni sono resistenti a ipossia e eutanasia sono per decapitazione. Nella configurazione descritta sperimentale, i topi sono almeno 14 giorni e può essere eutanasia da CO 2 asfissia. 5,7-piastre di agar sangue possono essere completate con 5μg/ml gentamicina per prevenire la crescita di batteri commensali in omogenati di tessuti nasali. La gamma di diluizioni utilizzato dipenderà dal S. pneumoniae ceppo utilizzato. Per gli esperimenti in 20 giorni i topi vecchi con S. pneumoniae ceppo EF3030, usiamo pulito, 10e-1, 10e-2 e 10e-3. 5,8 Conservare ogni campione di tessuto omogeneizzato in almeno due aliquote, in modo che un campione di backup è disponibile nel caso in cui il test targa virus non riesce! Un titolo preciso virale può essere ottenuto soltanto da un campione, una volta scongelato dopo il congelamento, ma non da campioni ripetutamente congelamento scongelati. 6.1 Quando cresciuto 90-100% confluenti, un singolo 150 centimetri 2 fiasco coltura tissutale produrrà abbastanza cellule MDCK per cinque-sei pozzetti. 6.5 La diluizione ottimale di serie dipende dal ceppo virale utilizzato e il tempo dopo l'infezione. Tipicamente, useremmo pulito, 10e e 10e-1-2 diluizioni per organo omogenati preso 6 giorni dopo l'infezione da virus dell'influenza. 6,6 L'uso di diluizioni seriali di magazzino virus è un controllo appropriato positivo per l'uso in ogni test placca. Come controllo negativo, RPMI + può essere utilizzato. 8. Rappresentante dei risultati: Figura 1. Schema di uova embrionate di pollo. Figura 2. BLI di S. pneumoniae infetti mouse sul giorno 3 e il 4 ° giorno dopo l'infezione con il virus dell'influenza finto. Figura 3. BLI di S. pneumoniae e l'influenza da virus co-infettati del mouse sul giorno 3 e il 4 ° giorno dopo l'infezione con il virus dell'influenza. Figura 4. Carica batterica nel naso di una singola e una co-infezioneTed mouse. Figura 5. Titoli virale nel naso e polmoni di una co-infezione del mouse. Media Contenuto 1,8% (w / v) agarosio Aggiungere 0,9 grammo di agarosio a 50 mL H 2 O distillata, sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 10 minuti. Trasferimento a 56 ° C a bagnomaria freddo. Doppia forza Leibovitz L15 medio (ds L15) 1 borsa di L15 polvere (per compensare 1L) è sciolto in 450 ml distillata sterile H2O e mescolato fino alla dissoluzione. Il pH è portato a pH 6,8 con HCl 1M. Poi completare con 4 ml del 7% (w / v) NaHCO3, HEPES 0,4 ml (0,5 M, pH 6,8), 200 U / ml di penicillina, 200 mg / ml di streptomicina, 60 mg / ml di gentamicina. Regolare il volume finale di 500mL e filtro sterilizzare. Horse Blood Agar (HBA) 4% HBA (Oxoid, Basingstoke, UK), DH 2 O, 7% (v / v) sangue di cavallo RF10 RPMI-1640 contenente 2mM glutammina, piruvato di sodio 2NM, 24 mg / ml di gentamicina, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 10% (v / v) di siero siero fetale di vitello. RPMI + RPMI-1640 contenente 2mM glutammina, piruvato di sodio 2NM, 24 mg / ml di gentamicina, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina Todd-Hewitt brodo + estratto di lievito 0,5% Todd Hewitt Broth (Oxoid, Basingstoke, UK) in dH 2 O integrati con il 2% (w / v) estratto di lievito Tabella 1. Supporti specifici utilizzati nel presente protocollo. Nome del materiale Tipo Azienda Numero di catalogo Commento RPMI 1640 medium Reagente Gibco 21870-076 Tripsina Reagente Worthington Corporation biochimici LS003740 TPCK trattati Leibovitz L-15 di media Reagente Gibco 41300-039 Agarosio, tipo I Reagente Sigma-Aldrich A6013 Usa bassa temperatura di fusione agarosio, come SeaPlaque agarosio Madin-Darby cellule di rene canino Reagente ATCC CCL-34 Tabella 2 reagenti e attrezzature specifiche.: Effetto sul benessere degli animali Da lieve a moderata segni uno Gravi segni b Non specifico segno (s): Aspetto Lieve a moderata piloerezione senza disidratazione (tenda pelle) Piloerezione, con la disidratazione (tenda pelle) Condizione corpo aumento di peso ridotto Nessun aumento di peso o di riduzione del peso Comportamento Misurate, ma reattivo, è diminuito l'interazione con i coetanei. Non risponde ad attività e provocazione. Isolati da altri fratellini Condizioni specifiche o anormale segno clinico (s): Assenza di posto del latte (<2-3 giorni di età) Cercate di incoraggiare allattamento se questo è stato osservato per <24 ore. Se nessuna prova di macchia del latte, anche con l'incoraggiamento dopo 24-48h, o se, ovviamente, non ha allattato, considerare l'eutanasia. Altri segni Fondo per cercare animali Manager / re degli animali da laboratorio veterinario consiglio: azioni appropriate o euthanise se l'animale è nel dolore moderato o grave o disagio Tabella 3. Criteri di intervento per i topi neonati (<21 giorni): a Quando uno o più 'lieve-moderata' segni sono osservati aumento della frequenza di osservazioni per due volte al giorno e chiedere consiglio al funzionario benessere degli animali, se del caso in modo che il trattamento e la cura può essere dato. b Quando uno o più 'gravi' sono stati osservati segni, euthanise i topi utilizzandometodo appropriato. I topi <10 giorni sono eutanasia per decapitazione, topi> 10 giorni sono l'eutanasia da CO 2 asfissia.