Stabile Profiling isotopica di Flux Intermediario Metabolica in fase di sviluppo e per adulti Caenorhabditis elegans</em

Protocollo A: Stabile profilazione isotopica del metabolismo intermedio durante C. sviluppo elegans su piastre NGM. * Nota: l'arricchimento isotopo stabile può essere misurato con successo nelle popolazioni di nematodi giovani adulti in seguito ad esposizione isotopo (sia con universalmente glucosio marcato con 13 C o 1,6 – 13 C 2-glucosio) a partire sia in prime fasi dello sviluppo o nella prima età adulta. Questo protocollo facilita il monitoraggio simultaneo di salute degli animali, lo sviluppo e la crescita su standard nematode crescita media (NGM) piatti, che non è così facilmente ottenibile in coltura liquida. La preparazione di 100 millimetri piatti di Petri con 10 ml di terreni di crescita nematode (NGM), per tecnica standard 1. Piastre NGM diffuso con OP50 E. coli 1 e lasciare asciugare durante la notte. Aggiungere 500 ml di 200 mM 1,6 – 13 C 2 glucosio (per ottenere una concentrazione finale di 10 mm sulla piastra NGM) uniformemente al piatto. Lasciare asciugare durante la notte. Bleach gravido vermi adulti 1. Piastra recuperato le uova su piastre NGM senza batteri o 1,6 – 13 C 2 glucosio. Incubare a 20 ° C durante la notte. Il giorno successivo, il trasferimento nati, L1, arrestato larve su piastre NGM precedentemente diffuso con 1,6 – 13 C 2-glucosio e OP50 E. coli (al punto # 2, sopra). Crescono i vermi allo stadio adulto giovane (48-72 ore, a seconda del ceppo), worm presa in carico non morire di fame. Raccogliere sincrono, primo giorno di vermi adulti giovani di piatti con 3-4 ml di S. basale. Lavare i vermi in 50 mL di S. basale in 50 mL tubi Falcon. Lasciare worm per far sedimentare per gravità per 5 minuti. Rimuovere il surnatante a ~ 5 ml. Ripetere il lavaggio altre due volte. Stima numero verme contando tre aliquote di 100 microlitri 2. Regolare la concentrazione verme a 1000 worm / mL di S. basale. Pipettare 1 ml (1000 vermi) in una provetta di plastica centrifuga 1,5 ml. Aggiungere 69 ml di 60% PCA contenente lo standard interno (ε-aminocaproico acido) ad una concentrazione finale del 4% PCA e 200 micromol di standard interno. Lasciate che i vermi risolvere per gravità x 5 minuti. Rimuovere e conservare il surnatante in un'altra provetta. Grind campioni verme utilizzando plastica omogeneizzatore (Kontes pellet Pestello) e motorizzato trapano (Kontes Pellet Motor Pestello cordless) per 15 secondi. Confermare visivamente interruzione verme al microscopio ottico. Ripetere se necessario. Trasferire il surnatante dal punto # 11 a combinare con omogenato dal punto # 12. Centrifugare campione a 2250 rpm (1300 xg) per 5 minuti. Trasferire il surnatante in fresco 7 tubo di vetro ml. Salva pellet per il saggio di concentrazione di proteine, come dettagliato nel punto # 20, di seguito. campioni a pH 7-8 (neutro) intervallo utilizzando 4N KOH. Centrifugare i campioni neutralizzato in 7 ml di tubo di vetro a 2250 giri al minuto (1300 xg) per 5 minuti per rimuovere i sali. Trasferire il surnatante in fresco 7 tubo di vetro ml. Preparare i campioni neutralizzato per la quantificazione metabolita da: Ad alte prestazioni (HPLC): separare 50 ml di campione neutralizzato per l'iniezione diretta in HPLC. Libero quantificazione amminoacido viene eseguita mediante HPLC (Varian) con derivatizzazione pre-colonna con rilevazione o-phthalaldehyde e fluorescenti, come descritto in precedenza 3-4. Gascromatografia / spettrometria di massa (GC / MS): Procedere con l'estrazione di campioni rimanenti neutralizzato utilizzando resine a scambio ionico (Bio-Rad) per GC / MS determinazione di arricchimento isotopico in aminoacidi e acidi organici, come descritto nel protocollo D. Aggiungere 1 ml di NaOH 1N alle proteine ​​pellet rimanenti (dal punto # 15) in 7 ml di tubo di vetro. Incubare NaOH campione sottoposto a trattamento di proteine ​​a temperatura ambiente durante la rotazione (Labnet * Rotator LabRoller) durante la notte fino alla dissoluzione. Usa 75-100 ml di NaOH trattati con proteina per determinare la concentrazione di proteine ​​con metodi standard (DC Protein Assay, Bio-Rad). Protocollo B. profilazione Stabile isotopica del metabolismo intermedio in C. elegans giovani adulti in coltura liquida. * NOTA: effetti farmacologici sul flusso metabolico intermediario nei nematodi adulti possono essere studiati seguendo inizio isotopiche esposizione il primo giorno di deposizione delle uova sia su piastre NGM (vedi protocollo A, sopra) o in coltura liquida. Noi preferiamo il secondo approccio per massimizzare l'efficienza dei costi di isotopi stabili e l'utilizzo agente farmacologico. Diluire sincrono, primo giorno di deposizione delle uova giovani adulti in basale S. contenente 0,0005% di colesterolo (ottenuto con l'aggiunta di 0,5 ml di 1% di colesterolo (sciolto nel 95% etanolo) a 1L di S. basale) a 2000 capi per 500 microlitri. Impostare ~ 4 cultura volume totale mL (s) in 25 mL beute, come segue: TRATTAMENTO: NESSUNO "DROGHE A" S. basale di colesterolo 3020 microlitri 3020 uL – "A Drug" volume Isotopi stabili (1,6 – 13 C 2-glucosio) 80 microlitri 80 microlitri K12 E. coli (OD 660 2,5-3) 400 microlitri 400 microlitri Worms Giovane adulto (2.000) 500 microlitri 500 microlitri Un farmaco (concentrazione desiderata) – Come desiderato Coprire con un foglio di fiaschi. Agitare palloni per 24 ore a 220 rpm a 20 ° C incubate piattaforma shaker. Assicurarsi che fiaschi non sono completamente sigillate, come l'ossigeno è necessario per flusso intermediario metaboliche e per conseguente etichettatura dei metaboliti endogeni nematode. Lavare i vermi con l'aggiunta di 4 volumi cultura ml a 46 ml di S. basali in un tubo di plastica 50 ml. Lasciare worm per far sedimentare per gravità per 5 minuti. Vuoto di aspirazione surnatante fino a ~ 5 rimane ml. Ripetere il lavaggio di riempimento del tubo altre due volte a 50 ml con S. basale. Concentrato worm lavato a 1000 worm / ml in un tubo di plastica centrifuga 1,5 ml. Aggiungere 69 ml di 60% di acido perclorico (PCA) e 2 ml di 10 micron di standard interno (ε-aminocaproico acido) per ottenere una concentrazione finale di 200 micromol livello interno e il 4% PCA. Preparare i campioni come passi al # 11-22 nel protocollo A. PROTOCOLLO C-1. Monitoraggio dell'utilizzo isotopica in vermi adulti su piastre tracciando carbonica marcata anidride carbonica atmosferica e sciolto. * NOTA: Mentre i protocolli A e B dettaglio i metodi di monitorare incorporazione isotopo in metaboliti libero entro le viti senza fine in 2-3 giorni di sviluppo o di 1 giorno di vita adulta, rispettivamente, al lordo conferma del successo e della cinetica di incorporazione isotopica su un percorso breve periodo di tempo (cioè, a pochi minuti a ore) si può ottenere l'etichetta di monitoraggio di anidride carbonica atmosferica (CO2) rilasciato dai vermi o contenuto in anidride carbonica disciolta all'interno estrarre worm. Batteri vivi o morti possono essere alimentati a worm se coltivate su piastre (PROTOCOLLO C-1). I batteri non è necessaria per esposizione a breve termine isotopo di vermi in coltura liquida (PROTOCOLLO C-2). La preparazione di 100 millimetri piatti di Petri con 10 ml di agar NGM. Diffusione piastre NGM con vivo o UV ucciso OP50 E. coli (come mostrato nella Figura 1). Lasciare le piastre ad asciugare durante la notte. Aggiungere 500 ml di 200 mM 1,6-etichetta-13 C 2-glucosio a piastre diffusione OP50 NGM (per la concentrazione degli isotopi finale di 10 mm sulla piastra NGM). Lasciare le piastre ad asciugare durante la notte. Ottenere sincrono, primo giorno di deposizione delle uova, vermi adulti giovani cresciuti su piastre di agar NGM diffusione solo con OP50 E. coli. Trasferimento 1000 vermi adulti giovani a piastre di agar sperimentale NGM contenenti isotopi stabili ed E. coli (preparato come passi per # 1-2, sopra). Inserire la piastra di NGM sperimentale (senza copertura) in camera di vetro personalizzati dotati di ben chiuso 3-way rubinetto per consentire il campionamento atmosfera preciso e sostituzione. Sigillare immediatamente camere con disco di vetro otticamente trasparente. Coprire cucitura dove il vetro si siede su disco piatto con grasso ad alto vuoto per sigillare. Tempo di record "0 Time". Campione di 10 mL di atmosfera da camera di vetro con rubinetto a 3 vie con una siringa da 20 ml al minuto 30, 60, 90 e 120. Trasferire ciascun campione atmosferica per un pre-preparato 10 ml tappo di gomma in cima tubo di vetro contenente 1 ml di mM NaHCO 1 3 a 0,1 N NaOH che è stato sottovuoto. Iniettare 10 ml di ritorno d'aria in ogni camera di vetro con rubinetto a 3 vie con una siringa da 20 ml. Chiudere rubinetto alla camera dopo il campionamento / reintroduzione atmosfera e prima di riprendere il tempo di incubazione tra i punti di raccolta. Iniettare 100 ml di acido fosforico 20% attraverso il tappo in 10 mL tappo di gomma in cima tubo di vetro contenente CO2 nell'atmosfera campione. Rimuovere 2 ml di atmosfera e di iniettarlo in 12 ml blu-top autocampionatore tubi pre-riempita con elio per misura del CO 2 atmosferica. Analizza "atmosferica di CO 2 campioni" di Mass Spectrometer Gas-Ratio (ThermoQuest Finnigan Delta Plus). Camere di vetro aperta successivo periodo di due ore di incubazione isotopo e la raccolta di tutti i campioni atmosferici. Lavare i vermi off di piastre NGM in 3 mL di S. basale. Lavare i vermi in 50 mL S. basali in 50 mL tubi Falcon. Ripetere il lavaggio altre due volte. Concentrato worm per ~ 1000 worm / ml in 7 mL a fondo rotondo tubo di vetro (s). Vuoto del tubo di vetro con tappo di tenuta in gomma. Aggiungere 100 uldi acido fosforico 20% attraverso il tappo di gomma con la siringa per rilasciare disciolta di CO 2. Rimuovere 2 ml di atmosfera e di iniettare in 12 ml blu-top autocampionatore tubi pre-riempita con elio per disciolta misura del CO 2. Analizza "sciolto CO 2 campioni" da Gas-Rapporto di spettrometro di massa (ThermoQuest Finnigan Delta Plus). Alternative protocollo (C-2): utilizzo di monitoraggio isotopica in vermi adulti in coltura liquida tracciando carbonica marcata anidride carbonica atmosferica e sciolto. Ottenere sincrono, primo giorno di deposizione delle uova, vermi adulti giovani cresciuti su piastre di agar diffusione NGM con OP50 E. coli. Lavare i vermi in 50 mL di S. basali in 50 mL tubi Falcon. Lasciare worm per far sedimentare per gravità per 5 minuti. Rimuovere il surnatante a ~ 5 ml. Ripetere il lavaggio altre due volte. Trasferimento 1000 vermi adulti giovani in 1 ml S. basale a 10 ml a fondo rotondo tubo di vetro. Aggiungere 10,1 ml di 1 M di magazzino universalmente marcata con 13 C-glucosio per 1 ml di vermi per raggiungere la concentrazione finale di 10 mm. Ossigenare il fondo rotondo tubo di vetro contenente i vermi e di isotopi attraverso lo scambio con l'atmosfera che scorre ossigeno al 100% nel tubo aperto per 2 minuti. Chiudere immediatamente tubo con tappo di gomma. Agitare i tubi sperimentale in 20 ° incubate piattaforma C shaker a 220 rpm. Record di partenza tempo come "0 Time". Campione di 5 ml di atmosfera da 10 ml a fondo rotondo tubo di vetro con una siringa da 10 ml e 25 gauge attraverso il tappo di gomma ai minuti 30, 60, 90 e 120. Trasferire ciascun campione atmosferica per un pre-preparato, tappo di gomma in cima provetta da 10 ml di vetro contenente 1 ml di 1 mM NaHCO 3 a 0,1 N NaOH che è stato sottovuoto. Iniettare 5 ml di ritorno d'aria in ogni sperimentale a fondo rotondo tubo di vetro contenente i vermi e di isotopi con tappo di gomma con una siringa da 10 ml e 25 gauge. Curriculum di incubazione di 10 mL sperimentale a fondo rotondo tubi di vetro contenenti worm e di isotopi agitando a 220 giri al minuto di tempo tra i punti di raccolta. Iniettare 100 ml di acido fosforico 20% attraverso il tappo in atmosfera contenente tappo di gomma in cima provetta da 10 ml di vetro. Rimuovere 2 ml di atmosfera e di iniettare in 12 ml blu-top autocampionatore tubi pre-riempita con elio per misura del CO 2 atmosferica. Analizza "atmosferica di CO 2 campioni" di Mass Spectrometer Gas-Ratio (ThermoQuest Finnigan Delta Plus). Alla fine del periodo sperimentale, lavare i vermi in 50 mL S. basale in tubo da 50 ml Falcon. Lasciare verme pellet a formare per gravità. Vuoto di aspirazione surnatante fino a ~ 5 rimane ml. Ripetere il lavaggio per altre due volte in 50 ml di S. basale. Concentrato worm per ~ 1000 worm / ml in 7 mL a fondo rotondo tubo di vetro. Aggiungi tappo di gomma e sigillo di tubo a vuoto. Aggiungere 100 ml di acido fosforico al 20% utilizzando una siringa da 1 ml con un ago da 25 attraverso il tappo di gomma a rilascio di CO 2 disciolta verme. Rimuovere 2 atmosfera ml e iniettare in 12 ml blu-top autocampionatore tubi pre-riempita con elio per disciolta misura del CO 2. Analizza "sciolto CO 2 campioni" da Gas-Rapporto di spettrometro di massa (ThermoQuest Finnigan Delta Plus). Protocollo D. Elaborazione neutralizzato campioni di protocolli A e B per l'analisi degli aminoacidi e degli acidi organici mediante gascromatografia / spettrometria di massa. Bead Preparazione: Aggiungere 1 N HCl a entrambi Ag Ag 1 e 50 perle separatamente in bicchieri di 1L. Mescolare ogni pallone per 30 minuti con agitatore magnetico. Lavare con acqua deionizzata perline 10 volte fino a pH di lavaggi sono uguali a pH dell'acqua. Colonna Preparazione: Inserire un tappo di cotone appena sopra la parte più stretta della punta della pipetta Pasteur. Aggiungi perline carico a ciascuna delle due colonne per ogni campione, riempiendo ciascuno a circa un terzo dell'altezza della colonna. Usa AG1 perline per l'estrazione di acidi organici. Usa AG50 perline per l'estrazione di aminoacidi. Esempio di elaborazione: Aggiungere 500 l di campione alla colonna con perline AG1 carica. Nulla è aggiunto al campione (vedi PROTOCOLLO A, punto # 19B) prima di applicare a AG1 colonna per estrarre acidi organici, se il campione è già a pH neutro. Aggiungere 1 ml di HCL 0,1 N al campione rimanente prima di applicarlo alla colonna AG50 per estrarre aminoacidi. Attendere che i campioni per eseguire completamente attraverso le colonne. Lavare la colonna con acqua 10 volte fino a lavaggi sono neutrali (7-8 range di pH). Eluire colonne i prodotti freschi, etichettati 4 flaconcini di vetro ml di campione: Per l'estrazione degli acidi organici, aggiungere 3 ml di 3 N HCl a AG1 colonna. Questo permette l'analisi degli isotopi di arricchimento nel numero totale di atomi di carbonio marcato tra i 3-carbonio specie (lattato), 4-carbonio specie (aspartato, succinato, malato),5-carbonio specie (glutammato), e 6-carbonio specie (citrato). Per l'estrazione degli amminoacidi: aggiungere 3 ml di 4 N NH 4 OH per AG50 colonna. Questo permette l'analisi degli isotopi di arricchimento nel numero totale di atomi di carbonio marcato tra i 3-carbonio specie (alanina) e 5-carbonio specie (glutamina). Mettere il campione in fiale riattiva Vap III evaporatore durante la notte fino a secco. E. Derivitization campione e impostazioni della macchina per la Spettrometria di Massa Aggiungere 50 ml di acetonitrile e 50 ml di n-metil-nt-butyldimethylsilyl Trifluoroacetamide (MTBSTFA) per ogni flaconcino campione. Cover, mix e incubare per 30 minuti a 60 ° C. Iniettare 1-2 microlitri per ogni campione in gascromatografia / spettrometro di massa (GC / MS). F. Analisi dei risultati Quantificazione dei picchi di aminoacidi. La determinazione quantitativa di ogni amminoacido mediante l'analisi HPLC è calcolata utilizzando l'area di ogni picco rispetto a quella dello standard interno. Calcolo di arricchimento isotopico. Stabile arricchimento isotopico è calcolato in Excel (Microsoft) per ogni specie secondo la seguente formula: Percentuale eccesso Atom, corretto (APE) = (R sa-R °) * 100 / [(R sa-R st) 100], dove R sa – rapporto tra il campione e R ° – Rapporto dello standard. Valutare differenze statistiche tra l'arricchimento del campione. Student t-test è utilizzato per valutare la significatività dei relativi aminoacidi e le differenze etichetta isotopica tra i campioni. RAPPRESENTANTE RISULTATI: Isotopo stabile è ben incorporata in vermi adulti giovani, come dimostra carbonica marcata misurata di CO e CO 2 atmosferica verme sciolto 2. In vermi nutriti vivo o UV-irradiati ucciso OP50 E. coli, il rapporto di 13 CO 2-12 CO 2 era maggiore nel disciolta di CO 2 verme frazione rispetto al rilascio in atmosfera di CO 2 (Figura 1). Worm alimentazione dal vivo o ucciso OP50 E. coli non ha alterato significativamente la misurava 13 CO 2-12 CO 2 rapporto in estratto verme lavato (vedi PROTOCOLLO C1). L'esposizione prolungata a isotopo stabile del primo periodo larvale maggiore arricchimento isotopico in metaboliti intermedi. Corretto eccesso Percentuale atomi di carbonio etichettati determinato in metaboliti intermedi di giovani adulti wild-type worm è stato maggiore tra tutte le specie di glutammato, quando i vermi sono stati alimentati universalmente marcata con 13 C-glucosio e batteri vivi durante lo sviluppo rispetto agli animali nutriti trattamenti analoghi batteri etichettati per 48 solo poche ore dopo aver raggiunto la deposizione delle uova stadio adulto (Figura 2). Effetto di compensazione volte su arricchimento isotopico. Indipendentemente dal timecourse esposizione, tutti gli animali cresciuti su piastre sono state 'cancellate' di etichetta isotopica prima della preparazione a valle per GC / MS analisi. Confronto di protocolli di compensazione è stata effettuata, come mostrato nella Figura 2, compresa l'alimentazione worm per 2 ore su piastre di agar diffusione NGM vivere con nuovi batteri senza isotopo o di alimentazione su piastre di agar NGM senza batteri per 2 ore, e l'alimentazione su piastre di agar NGM senza batteri per 2 o 6 ore. Indipendentemente dal corso dell'esposizione isotopica, nessuna differenza significativa arricchimento isotopico in metaboliti intermedi da giovani adulti estratto verme intero è stata osservata quando gli animali sono stati liquidati senza batteri su piastre per 2 o 6 ore. Al contrario, l'arricchimento isotopico meno è stato osservato in metaboliti intermedi in cui gli animali sono stati poi 'cancellato' di isotopo in eccesso si nutrono di batteri senza etichetta per due ore. Tuttavia, un maggiore arricchimento a +3, +4, e +5 specie è stata evidente quando i vermi sono stati esposti a isotopo del primo periodo larvale. Pertanto, il protocollo di compensazione ottimale è stato determinato in compensazione vermi dopo la loro incubazione su piastre NGM diffuso con isotopi stabili e batteri con successiva incubazione per 2 ore su piastre NGM unspread. Di nota, vermi cresciuti in coltura liquida sono stati lavati chiara etichetta isotopiche e batteri in tre volumi di S. basale (vedi protocollo B); GC / MS di lavaggi non ha mostrato alcuna significativa arricchimento isotopico dal terzo lavaggio. Worm rettifica ceduto arricchimento massima in metaboliti intermedi. Per ottimizzare l'arricchimento per cento in metaboliti intermedi seguenti condizioni di trattamento analogo, il confronto è stato fatto di campioni verme interrotta da sonicazione da soli o sonicazione più di rettifica. La figura 3 mostra che i vermi interrotto in seguito all'esposizione isotopo mediante ultrasuoni, più rettifica avuto maggiore arricchimento isotopico rispetto ai campioni interrotto solo mediante ultrasuoni. Questi dati suggeriscono che le frazioni più sub-organismal sono stati interrotti dalla macinazione che per sonicazione. Studi successivi hanno rivelato rettifica da solo senza sonication è stato sufficiente per ottenere la massima arricchimento isotopico (dati non riportati). Esposizione verme intero isotopica permette l'analisi di flusso via metabolica intermediario. Alimentazione vermi che vivono con isotopi stabili precursore sia durante lo sviluppo (PROTOCOLLO A, Figura 4A) o all'inizio negli animali da stadio adulto (PROTOCOLLO B, Figura 4B) permette l'analisi sensibili dell'arricchimento isotopico tra i metaboliti indicativi di flusso attraverso la glicolisi (lattato, alanina), il piruvato metabolismo (alanina), e il ciclo degli acidi tricarbossilici (citrato, malato, succinato, aspartato, glutammato e la glutammina). Universalmente marcato 13 C-glucosio fornisce l'etichettatura robusta di tutte le specie di carbonio, mentre l'utilizzo di 1,6 – 13 C 2-glucosio permette di etichettatura affidabile solo in uno specie di ogni metabolita. Questa tecnica può sensibilmente discernere differenze da wild-type flusso metabolico intermedio tra vite senza fine della catena respiratoria mitocondriale ceppi mutanti, come il complesso III subunità della catena respiratoria mitocondriale mutante isp-1 (qm150). La Figura 5 illustra l'entità delle differenze osservate in etichetta assoluta tra isp-1 (qm150) e vermi N2 ogni esposte per 24 ore a 1,6 – 13 C 2-glucosio in coltura liquida con K12 E. coli dal primo giorno di deposizione delle uova stadio giovani adulti (protocollo B). Ulteriori studi isotopici stabili in una gamma di mitocondriale vermi mutanti sono in corso. Figura 1. Universalmente marcato 13 C-glucosio isotopo stabile è stato ben incorporato nel vermi adulti giovani 13 CO 2: 12. CO 2 rapporto (cento atomi in eccesso (APE), corretto) nel wild-type (N2) vermi due ore successive alimentazione universalmente etichettati 13 C-glucosio e uno ai raggi UV uccisi o OP50 batteri su piastre (PROTOCOLLO C1) 13. incorporazione C in metaboliti worm è stato robusto, dopo due ore di esposizione isotopo. Barre blu e rosso indicano relativo arricchimento isotopico in fase gassosa ("atmosferica di CO 2") e fase liquida ("verme di CO 2"), rispettivamente. Figura 2. Esposizione prolungata isotopo del primo periodo larvale e successivamente 'compensazione' vermi su piastre di agar NGM senza batteri maggiore arricchimento isotopico in glutammato libero di vermi adulti giovani. Arricchimento isotopico in specie glutammato è indicato per i vermi nutriti con piastre di agar NGM con universalmente marcato- 13 C-glucosio e OP50 batteri sia durante lo sviluppo dalla fase larvale L1 attraverso la fase di 959 adulti di cellule giovani ("L1", vedere PROTOCOLLO A), o per 48 ore dall'inizio, quando i vermi raggiunto il primo giorno di deposizione delle uova giovani stadio adulto ("YA"). Asse X indica il numero totale di atomi di carbonio etichettate in ogni specie glutammato. Asse Y indica la percentuale di arricchimento (atomi corretto per eccesso (APE)). Le barre verdi indicano worm cancellato in seguito all'esposizione degli isotopi di alimentazione OP50 E. coli senza isotopo su piastre NGM per due ore prima dell'estrazione PCA. Barre blu e grigio indicano worm cancellato in seguito all'esposizione isotopo su piastre NGM senza batteri o isotopo per due o sei ore, rispettivamente, prima dell'estrazione PCA. Figura 3. L'interruzione worm dalla macinazione di rendimento massimo arricchimento isotopico in metaboliti verme intermediario. Percentuale di arricchimento di carbonio misurata in uno specie di citrato nelle wild-type vermi trattati per 24 ore in coltura liquida con 1,6 – 13 C 2-glucosio senza batteri (PROTOCOLLO B). Barre nere e grigie indicano i vermi che sono stati interrotti solo da sonicazione o sonicazione e rettifica, rispettivamente. Arricchimento isotopico in seguito all'esposizione a 1,6 – 13 C 2-glucosio è meglio valutata in metaboliti indicato su un atomo di carbonio. Al contrario, l'etichetta si arricchisce in tutte le specie di ogni metabolita quando universalmente etichettati-13 C-glucosio viene utilizzato. Figura 4. Risultati rappresentativi illustrano il grado di arricchimento isotopico in metaboliti intermedi verme indicativa del flusso attraverso la glicolisi, il metabolismo del piruvato, e il ciclo degli acidi tricarbossilici. Corretto per cento atomi in eccesso (APE) è stata determinata in giovani adulti wild-type (N2 Bristol) vermi seguenti 1, 6-13 C 2-glucosio esposizione sia (A) durante lo sviluppo dalla fase L1 su piastre (PROTOCOLLO A), o (B) a partire dal primo giorno di deposizione delle uova, come i giovani adulti per 24 ore in coltura liquida (PROTOCOLLO B) . Le barre di errore indicano la deviazione standard in cui i dati isotopici affidabile da tre repliche biologiche era disponibile. <p class= "Jove_content"> Figura 5. Assoluto quantificazione degli aminoacidi di specie aminoacidi metabolita nel wild-type e mitocondriali ceppi mutanti verme. Etichetta assoluto in ogni specie di quattro amminoacidi è stata calcolata moltiplicando HPLC-determinata concentrazione di aminoacidi liberi (nmol / mg di proteina verme) da correggere per cento in eccesso atomi (APE) per ogni specie. Barre grigie e nere indicano wild-type (N2 Bristol) e mitocondriale complesso subunità III ceppi mutanti (isp-1 (qm150)), rispettivamente. Le barre indicano la media di tre esperimenti biologici replicare per ceppo.