Soğuk önkoşullamanın nöro-Çalışması için Stratejiler

Steril ve aseptik teknikler hazırlanması, bakım ve dilim kültürlerin uzun süre kullanımı için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, sadece 18 gün sonra in vitro dilim kültürlerin kullanımı için gerekçe, eksitatör gösterir ve inhibitör sinaptik iletim, en olgun hale gelir ve glia (astrositler ve mikroglia) sükunet ve tutarlı hale kanıtlara dayanır (Şekil 1 in vivo meslektaşları .) 1. Hipokampal Dilim Kültürler Hazırlık ve Bakım Kültür, aynı gün, 50 ml Bazal Orta Kartal, 25 ml Earle Kullanıcı Dengeli Tuz Çözüm, 23 ml At serum, 0.5 ml Glutamax (200 mM stok), 0.1 ml gentamisin (1.1 mL büyüme ortamı steril uçlar dengelenmesi 10 mg / ml stok), 0.4 ml Fungizone (250 mg / ml), 1,45 mL D-glukoz (% 45; 42 mM toplam). 36 kuvöz altı kuyu tepsileri tutun ° C,% 5 karbon dioksit ve% 95 nem. Maksimum sterilite, kültür, aynı zamanda kendi kendine yeten bir ultraviyole ışık, hava temizleme hayranları ile saflaştırılmış hava ile HEPA filtreli pozitif basınç kültür odası ideal yapılır ve temiz bir laboratuvar önlüğü ve steril eldiven giyerek laboratuvar ceket kolları üzerine gerilmiş . Dilim, gerekli tüm malzemeleri (yani, McIlwain doku kıyıcı, ilgili Teflon ekler, jilet bıçaklarla, soğuk diseksiyon (3-4 ° C) plakası, cerrahi aletler, ve diseksiyon Petri kapları) içeren bir BSL-1 laminer davlumbaz kültürler hazırlayın Wild (M8) stereomikroskopta. Diseksiyon alanı ve araçların daha fazla kısırlık kurmak için diseksiyon malzemeleri ultraviyole ışığa maruz aynı zamanda soğutma plakası (Yakın bir yerde su banyosu çalışma) en az 30 dakika boyunca 3-4 ° C sıcaklık ulaşmak için izin verin. Laminer akış kaputu periyodik ultraviyole ışık, kısa dalga ultraviyole ışık ölçüm metre ile masaüstü seviyesinde yeterli gücü sağlamak için test edilir. Sıçan yavrular kullanın (P8 P9 ve ~ 23 g / adet doğumda 10 itlaf litre)% 100 karbon dioksit, kaput, duman ve temizlenmiş arkasında aseptik bankta küçük bir hayvan kutusu içinde% 100 etanol daldırma ile anestezi davlumbaz, sonraki tüm adımlar yapılır. 100 mm Petri kabında bir yarısında yavrular başını kesmek ve yavru başına yeni bir çanağı kullanarak, yılın ikinci yarısında baş. Beyin inceleyin ve alt yarısını içeren bir 60 mm Petri kabı içine yerleştirin 10 ml steril soğuk (3-4 ° C) 6.5 D-glukoz ile desteklenmiş Gey Dengeli Tuz Çözeltisi mg / ml (yani 7.5 ml, 45 Gey Kullanıcı 500 ml şişe başına% d-glukoz. Her yarımkürede hipokampus inceleyin ve McIlwain kıyıcı Teflon disk üzerine koyun. Uzak kalarak kesme bıçağı kesim beyin bölümleri önlemek için bir iris spatula ile beyin doku yayıldı medya. Kesit kalınlığı 350-400 mikron, McIlwain kıyıcı kullanarak uzun eksenine Bölüm hippocampi dik. Teflon ekler briskly taze dilim kesmek ve üst yarısında içeren soğuk (3-4 ° C) 6.5 mg / ml bir ml pipet kullanarak D-glukoz ile Gey Dengeli Tuz Çözeltisi. 60 mm Petri kabı içine yıkayın Sağlam bir dentat girus ve piramidal hücre katmanı stereomicroscope altında dilim inceleyin. Yavaşça bir kuluçka normal inkübasyon koşulları altında bir ekleme üzerine büyük dilim (eklemek başına üç ve 12 dilim / yavru) yerleştirmek ve korumak her altı ayda bir temizlenmesi ve bir kızılötesi karbon dioksit analizörü ve bir ondalık basamağa kadar doğru bir termometre ile her üç ayda bir kalibre. Refresh büyüme ortamı kültür yemekler BSL-2 kaput ve steril tekniği kullanarak in vitro olarak her 3-4 gün. In vitro olarak 7 gün sonra, 97 ml Neurobasal, 2 ml B27, 0.5 mL Glutamax (200 mM), 0.1 ml askorbik asit (0.5 M) ve 0.68 ml oluşan 1.1 mL serum serbest medya (SFM) medya yerine D- Glikoz (% 45; 42 mM toplam). 2. Dilim Kültürler ön ekran Vitality Kısım Sytox Yeşil stok (10 mcL) ve -20 ° C'de saklayın Sytox stok konsantrasyonu serum serbest büyüme ortamı (yani 100 ml medya 10 mcL) çalışan 500 nM sulandırınız. Mağaza Sytox medya 4 ° C ve bir hafta kadar kullanın. 1.1 6 kuyu kültür yemekleri de ortalama Sytox mL ve sıcak 36 ° C yeterli bir süre için% 5 karbon dioksit (yani, kültür kaplarına kondens eksikliği kanıtladığı gibi). Bu arada, stabilize güç kaynağı ile çalışan bir ultraviyole lambası (yani, bir FITC filtre ile floresan ışık kaynağı) en az 20 dakika boyunca sıcaklığına eşit ışık yoğunluğu sağlamak için izin verir. Yeri dilim kültürleri (18 günsonra 10 dakika süreyle Sytox-media in vitro) ve geri dönüşü olmayan CA1 piramidal tabakası hasarı için ekran SFM. 5x büyütme altında incelenir ters bir mikroskop, bir aseptik yüzey kültürleri. CA1 alanda az 30 Sytox pozitif hücrelerin kültürleri kabul edin. 3. Soğuk Önkoşullama 6-kuyu kültür yemekler SFM Yeri 1.1 mL. Soğutmalı medya (örneğin, 30 ° C) Kullanmadan önce en az 20 dakika süreyle bir inkübatör (% 5 karbon dioksit ve% 95 nem) dengelenmesi için izin verin. Kültür kaplarına kondens olmaması dengelenme için yeterli zaman meydana geldiğini gösterir. Soğutmalı medya (1.1 mL / iyi) BSL-2 davlumbaz steril tekniği kullanarak 90 dakika boyunca 30 ° C ve inkübe muhafaza tepsisi kesit kültürü ekler aktarın. BSL-2 davlumbaz ile tekrar steril tekniği kullanarak 24 saat boyunca normal inkübasyon koşulları altında normal bir SFM dilim kültürleri içine yerleştirin. 4. Eksitotoksik Yaralanma 20 dakika için Sytox medyaya teşhir ederek kültür deneysel kullanım prescreen dilim başlayın. Bakımı, prescreen (arka plan görüntüleri) için kullanılan benzer bir oryantasyon ile bireysel dilim dilim görüntüler elde. Bu her ekleme saat "iki" 10 "ve marker kalem ile sağa sola bir işareti koyarak ve iki işaretleri yapılır. Bu manevra, görüntülerin her kültür için aynı faiz şeklin alanını kullanarak kolaylaştırır. Aynı zamanda, ultraviyole lamba kaynağı (düzenlenir güç kaynağı altında) açın ve en az 20 dakika sıcaklık böylece sıcak bir CCD kamera. Sonra, bir fluoroscein standart ile kalibre CCD kamera. "Temizle" CCD 50 devir için otomatik olarak kalibrasyon CCD kamera kullanılmadığı sürece ışık güneş ışığına. MetaMorph içinde yaralanma ölçümü için kullanılan Soğuk Ek Bileşen kamera temizlemek için bir program kurduk. 90 ml PBS (10 mM fosfat tamponu, 150 mM NaCl, 7.3 pH) ve vorteks fluoroscein Yeri 10 mcL. Pipet 10 mcL 100 mikron derin hemasitometre üzerine fluoroscein karışımı. 1000/4096 tam görüntü yoğunluğunu ayarlayın. Soğuk önkoşullamanın (yani ≥ 250 CA1 alan faiz yoğunluğu ile kültürler silmek) yaralanmaya neden vermedi doğrulamak dilim kültürlerin arka plan resimleri toplayın. NMDA medya ile tepsiler hazırlayın. NMDA 10 mM stok solüsyonu haftada en az hazırlayın. Eksitotoksik yaralanma, SFM 20 50 mcM NMDA sulandırmak ve en az 20 dakika için normal inkübasyon koşullarının dengelenmesi. Normal kuluçka şartlar altında 60 dakika NMDA-medya BSL-2 başlık ve steril tekniği, yer ekler. Içeren 10 ml Neurobasal, 36 ° C'ye kadar ısındı üç ayrı 60 mm yemekleri her ekleme üç kez daldırma ekler NMDA durulayın Üç 60 mm yıkama yemekler her set için üç ekler fazla kullanmayın. Normal inkübasyon koşulları kültürler dönün. 24 saat NMDA maruz kalma yara görüntüleri toplayın. Yukarıda açıklandığı gibi fluoroscein standart kamera kalibre edin. Sytox 20 dakika için medya yerleştirin kültürlerinde. Sakatlık Asitli: MetaMorph yazılımı kullanarak, CA1 bölgenin etrafında bir AOI çizin. Tedbir yoğunluğu için seçilen bölge "yaralanmalara neden olabilir." Kopyala ve yapıştır AOI "yaralanma" "arka plan" görüntü. Excel'e "yaralama" ve "background" değerleri girin. Kontrol ve Soğuk koşullanan kültürler Asitli "pay-arka plan". Istatistiksel yazılım (örneğin, SigmaStat) kullanarak, deneysel grup (lar) karşı, her zaman, her deneysel vadede dahil edilmelidir bir kontrol grubu, yaralanma karşılaştırmak için uygun istatistiksel testler çalıştırın. Not: bir günlük post-zarar görüntüler yaralanma seviyeleri düşük ise, taşıma, iki üç gün deneme. Kültürlerde Koruma yaralanma duyarlılık eksikliği (Şekil 2) nedeniyle maskelenmiş olabilir. Not: "koruma" meselesi, yaralanma seviyeleri ve tüm karşılaştırmalar için oranları (Şekil 3) ölçüm geçmek için istenir. 5. Soğuk önkoşullamanın Uygulamalı Co-tedavileri Dilim kültürlerinin önemli bir avantaj çevresel bir durumdurs doğru bir şekilde kontrol edilebilir. Bu sinyalizasyon bu sitokin anlamına gelir soğuk önkoşullamanın, ölçülen taklit ve kritik bir düğüm yönlerini incelemek için modüle edilebilir. Rekombinant (örneğin, agonist) proteinler ve nötralize (örneğin, antikor veya çözünen reseptör) proteinler, sırasıyla, sitokin sinyalizasyon taklit ve modüle etmek için kullanılabilir. Genel olarak, bu proteinlerin sulandırılmış ve yeterli biyoaktivite sağlamak için altı ay içinde kullanılmak üzere -20 ° C'de alikotları olarak saklanır. Burada, TNF-α sinyalizasyon kaldırılması çözünür TNF reseptörü 1 (sTNFR1) kullanarak örnek kullanımını tanımlamak. PBS içinde 50 mcg / mL stok, 20-50 mcL miktarda yılında kısım, ve -20 ° C'de saklayın albumin% 0.1 sığır serum sulandırın sTNFR1 Kullanımı için, sTNFR1 için 200 ng / ml dilim kültürleri büyüme medya 36 ısındı sulandırmak ° C ve 20 dakika süreyle soğuk önkoşullamanın önce sTNFR1-medya yer dilim kültürler. Not: varyans azaltmak için, vs (yani 50 mg / ml 10 ml büyüme ortamı sTNFR1 stok 1:250 dilüsyon 40 mcL sTNFR1 gerektirir) büyüme medyanın büyük bir hacim 200 ng / ml sTNFR1 sulandırmak için en iyi (1.1 mL medya başına 4.4 mcL) her iyi çanak doğrudan sTNFR1 ekleyerek. De her ekleme sTNFR1 200 ng / ml ve yeri medyada 1.1 mL sulandırınız. Medya, yukarıda açıklandığı gibi, 90 dakika süreyle soğuk önkoşullamanın dilim kültürler maruz önce en az 20 dakika süreyle 30 ° C gelmesini sağlayınız. Geri Place dilim kültürler 36 ° C sTNFR1 mevcut medya. 24 saat sonra, daha önce açıklandığı gibi 20 dakika Sytox medya kültürleri ortaya çıkarmak ve soğuk önkoşullamanın kültürler zarar vermedi doğrulamak için arka plan resimleri toplamak. Yukarıda açıklandığı gibi veri Asitli. In vitro Yenile medya bileşenleri ile her 3-4 gün. 6. Soğuk önkoşullamanın sonra derhal ve Gecikmeli eksitotoksik Yaralanma Hemen soğuk önkoşullamanın yaralanmalara neden olabilir. Yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirin soğuk önkoşullamanın. Soğuk önkoşullamanın sonra, 20 dakika için normal bir kuluçka kültürlerin geri. Daha sonra, bir saat boyunca 20-50 mcM NMDA yaralanma kültürleri ortaya çıkarmak. Kültürleri, yukarıda açıklandığı gibi üç kez durulayın ve normal bir kuluçka dönmek. Yukarıda açıklandığı gibi 24 saat sonra, yaralanma fotoğrafları kazanır. Soğuk önkoşullamanın etkileri gecikmelidir. Yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirin soğuk önkoşullamanın. NMDA yaralanma 24 saat sonra yukarıda açıklandığı gibi kültürler Açığa. Üç gün sonra ilk koruma izlemek için soğuk önkoşullamanın için yaralanma görüntüleri elde etmek için devam edin. 7. RNA İzolasyon Aşağıdaki gen ekspresyonu işlemleri tek bir dilim kültür ölçeklenir. 6-kuyu kültür yemekleri RNA stabilize etmek için 3 ml RNAlater büyüme medya ve normal bir kuluçka dilim kültürler aktarın. Üç gün kadar 4 ° C'de muhafaza aşağıda açıklandığı gibi işlenmiş kadar. 1 ml soğuk ince uçlu bir boya fırçası ve yer eklemek kapalı kesit kültürü yavaşça kaldırın (4 ° C) 1.5 mL PBS (DNaz, RNaz ve DNA ücretsiz) mikrosantrifüj tüp. 30 sn ve kaldır PBS süpernatant için örnekler santrifüjleyin. Mağaza numuneler -80 ° C Buz üzerinde dilim kültürleri (~ 250 ng / adet), çözülme örnekleri RNA izole etmek için. Qiagen MicroRNeasy kitini kullanarak, daha ayrıntılı olarak açıklanan ve RNeasy Micro El Kitabı (Qiagen) adapte aşağıdaki prosedürleri ile RNA izole edin. Tek bir kesit kültürü içeren her mikrosantrifüj tüpe Yeri 350 mcL Tampon RLT (ml başına 10 mcL β-mercaptoethanol içeren). 30 sn için vorteks örnekleri homojenize. Tampon RLT tamamen homojen kadar gerekli (yani, doku pelet hala görünür) bir tek havaneli kullanıyorsanız, doku Karışım. % 70 etanol lizat karıştırın ve karışımı için pipet içine yerleştirin 350 mcL. Toplama tüpüne bir spin kolon ve yeri (spin kolon ve toplama boru Qiagen tarafından sağlanmaktadır) Homojenat aktarın. Maksimum hızda 15 saniye için örnek Santrifüj. Sütun saklayın. 15 sn maksimum hız 350 mcL Tampon RW1 artı santrifüj ekleyerek spin kolon yıkayın. Tampon atın. 80 mcL toplam hacmi verim RDD 70 mcL Tampon DNaz I stokunun 10 mcL sulandırınız. Pipet hafifçe vorteks karıştırmayınız. Örnek başına seyreltilmiş DNaz stokunun 80 mcL hazırlayın. 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. 15 sn için spin kolon ve santrifüj örnek 350 mcL Tampon RW1 ekleyin. Toplama tüpüne atın. Yeni bir toplama tüpü kullanarak, 500 mcL Tampon RPE örnek ekleyebilir ve santrifüj 15 saniye süreyle ve tampon atın. Örnek ve santrifüj 2 dakika süreyle% 80 etanol 500 mcL yerleştirin. Toplama tüpüne atın. 5 açık tüp kapakları ile maksimum hızda dakika, toplama tüpleri silmek ve spin kolon kit tarafından sağlanan 1.5 ml toplama tüpüne transfer için santrifüj spin sütunları kurulayın. Spin kolon membran merkezine izole RNA yer 14 mcL RNaz-serbest su toplamak için. Bir dakika süreyle santrifüj ve sıvı toplamak. 2 RNasin mcL (1 TE tampon U / ml seyreltilmiş) ve mağaza -80 ° C TE tampon pH 8,0 10 mM Tris (tris [hidroksimetil] aminomethane), 1mm EDTA (ethylenediaminetetraacetic asit disodyum tuz hidrat) oluşur. 8. RNA Niceleme Not: RNasin RiboGreen testi ile karışmaz. RNaz-free TE tamponunda RiboGreen 1:200 sulandırınız aşağıdaki gibidir. TE (ml): 1; Ribogreen (mcL): 5; TE (ml): 4; Ribogreen (mcL): 20; TE (ml): 6; Ribogreen (mcL): 30 RNA standartları aşağıdaki gibi hazırlanmıştır. Maya tRNA RNA standart olarak kullanılır. tRNA saklanan (-20 ° C) 1 mg / mL TE tampon. 1 mcg / ml çalışma standardı (DNaz, RNaz ve DNA ücretsiz) üretmek için 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler kullanılarak, TE tampon 1 mg / ml stok 1:100 sulandırınız. Sonra yandaki tabloda gösterildiği gibi zaten plaka kuyularda 1 mcg / mL standart TE tampon içine uygun miktarda ekleyerek, TE tampon seyreltici ilk ekleyerek 96-floresan tahlil plaka doğrudan standart eğri hazırlayın. Her bir standart aşağıdaki gibi yinelenen kuyu olun. Vol. std. (McL): 100; Vol. TE (mcL): 0; de RNA (ng): 100; Vol. std. (McL): 80, Vol. TE (mcL): 20; de RNA (ng): 80; Vol. std. (McL): 60; Vol. TE (mcL): 40; de RNA (ng): 60; Vol. std. (McL): 40; Vol. TE (mcL): 60; de RNA (ng): 40; Vol. std. (McL): 20; Vol. TE (mcL): 80; de RNA (ng): 20; Vol. std. (McL): 0; Vol. TE (mcL): 0; de RNA (ng): 0 Testi şu şekilde hazırlanır. 96 plaka örnek kuyuların her biri için 99 TE tampon mcL ekleyin. Bunu yapmanın en etkili yolu, çok kanallı pipet kullanın. Deneysel örnek kuyu RNA 1 mcL ekleyin. Seyreltilmiş RiboGreen 100 mcL ekleyin ve her biri de çok kanallı pipet kullanarak bir ya da iki vuruş pipet ile çiğnemek. 480 nm eksitasyon ve 520 nm emisyon floresan plak okuyucu plaka okuyun. RNA standartları ölçülen floresan yoğunlukları ile Microsoft Excel kullanarak, standart bir eğri oluşturun. Standartları eğrisi elde edilen lineer denklem kullanarak örneklerinde RNA konsantrasyonları hesaplayın. 9 – SYBR Green Kantitatif PCR PCR prosedürleri en iyi RNA (Şekil 4) ile çalışmak için özel olarak ayrılmış bir temiz bir alanda yapılır. Uzakta ultraviyole ışık,% 10 çamaşır suyu veya RNaz kullanmadan önce potansiyel DNA kontaminasyonu ve RNaz faaliyet alanı ile ilgili laboratuar ekipmanları dekontamine. Tüm prosedürler boyunca eldiven giyin. Kiti ile sağlanan tüm prosedürler için RNaz ücretsiz su kullanın. DEPC-(diethylpyrocarbonate) arıtılmış su kullanmayın. PCR ile ilgili yabancı DNA geciktirir aerosol kontaminasyon için kullanabileceğiniz hemen sonra bütün tüpler kapatın. Geliştirilmesi ve ilgi mRNA hedef (ler) için primerler karakterize. Hulse ve ark Ek Yöntemleri Bu yöntemler, ayrıntılı olarak, Journal of Neuroscience, 13, 2008. cDNA iScript kullanarak ters transkripsiyon yoluyla 30-200 ng toplam RNA üretilir. RNA miktarı başlayan seçim, örnek bir kısmı (yani, toplam% 10 -% 20), RT-PCR analizi performans hedefi ile RNA toplam miktarı ile belirlenir. RNA kalan büyük kısmı gelecek analizi için saklanır. IScript kiti rastgele hekzamer ve oligo-dT primerler bir karışımı ve toplam hacmi 20 mcL değiştirilmiş bir MMLV ters transkriptaz kullanır. Ters transkripsiyon gelirleri için 25 ° C 30 dakika, 50 dakika ve ters transkriptaz 42 ° C 85 ° C 5 dakika sonra denatüre için. TE tamponunda son konsantrasyonu 0.4 ng / mcL akrabası RNA miktarı başlayan bir cDNA seyreltilir. SYBR Green PCR tabanlı strateji cDNA yükseltmek için kullanılır. PCR reaksiyonları SYBR Green dahil izleme, gerçek zamanlı olarak takip edilmektedir. 50 mcL reaksiyonlar 3 mM MgCl 2, 200 mcM dNTP, 15 pmol her ileri ve geri primerler içeren, 1 mcM floresein, 1x SYBR Green boya, cDNA 10 mcL (4 ng) dilim kültür ve tepki olarak 1.25 U Platinum Taq polimeraz 50 mM KCl ve 10 mM Tris, pH 8.3 oluşan tampon. PCR gerçek zamanlı veri toplamak iCycler PCR kullanılarak yapılır. Bisiklete binme, 30 sn / uzantısı tavlama (60 ° C) 45 kez tekrarlanan takip 15 sn denatürasyon (95 ° C) parametreleri oluşur. Optik ölçümler tavlama / uzantısı adım sırasında alınır ve Ct değerlerini iCycler sistem yazılımı kullanılarak belirlenmiştir. ilgi ve β-aktin sitokin hedefleri için cDNA standart eğrileri oluşturmak için kullanılır. Plazmid cDNA moleküler ağırlık ve kütle kopya sayısı belirlenir. Kopya sayısı / kütle standart eğrileri her tahlil inşa dahildir. Her cDNA seyreltme için Ct değerlerini kopya sayısı v. Ct eğrisi belirlemek için kullanılır. Sitokin ve β-aktin kopya sayısı düzeyleri standart eğrileri kullanılarak numuneler için belirlenir. 10 Kantitatif PCR için Mikroarray'ler Kantitatif gerçek zamanlı qPCR dizi tarama, düşük seviyeli inflamatuar mediatör ifade değişiklikler için prob için son derece hassas ve tekrarlanabilir demektir. SABiosciences RT2 Profiler PCR dizi üretici tarafından daha ayrıntılı olarak açıklanan aşağıdaki adımları, inflamatuar mediatör gen ekspresyon değişiklikleri için kullanılır. Tahlil 0.1-1.0 mg RNA kullanır. Biz yerel dilim alanlarda (örneğin, iki toplanmış örneklerinden sağlar ~ 250 ng toplam RNA CA1) veya benzer bir total RNA miktarını içeren tüm tek dilimleri kullanın. Örnek ve kontrol RNA'lar ters bir ilk iplikçik kiti (örneğin, C #-03) kullanılarak cDNA için transkripsiyonu. Çıkan cDNA SYBR Green tabanlı PCR karışımı (# PA-011) ve PCR dizi plaka (84 deneysel benzersiz genler ve 16 temizlik genler ölçüm) 96 kuyuların her birine aliquotted 25 mcL karıştırılır. Bir dizi plaka deneysel örnek hazırlanır ve ikinci bir plaka kontrolü için hazırlanmıştır. Not: üretici tarafından sağlanan SYBR Green master miks termal cycler özel. Termal bisiklet, 95 °, 60 dakika tek bir uzantısı adım takip ° C C. 15 saniye denatürasyon adım oluşan bir 40 devir protokolü ile bir iCycler kullanılarak yapılır Optik veri uzantısı adım sırasında tahsil edilir. Termal bisiklet, 0.5 ° C artışlarla, 55-95 ° C sıcaklık aralığı tarama erime eğrisi analizi ile takip edilmektedir. Tedavi ve kontrol plakalar genlerin göreceli ifade 2 kullanılarak tespit edildi – Excel tabanlı yazılım kullanarak ΔΔCt yöntem ve kontrollere göre bir kat artış veya azalma olarak ifade. Ifadesinde iki kat artar veya azalır Genler, bir sonraki değerlendirme için kabul edilir. (Soğuk önkoşullamanın # parn-011A kullanarak, örneğin) PCR dizi tarama tespit genler daha confirmed qPCR. PCR dizileri hangi genler uyaranlara yanıt olarak düzenlenmiştir tanımlar. Olumlu yanıt soğuk önkoşullamanın düzenlenir gibi soğuk önkoşullamanın örnek olarak, IL-11 gen belirledi. Analizin bir sonraki adım, yeni tanımlanmış bir gen, yukarıda ayrıntılı olarak qPCR tahlil kullanarak dilim kültürlerde düzenlenmiş olup olmadığını teyit etmek. 11. Multiplexed Microsphere akım sitometrik Proteomik Testi Yukarıda açıklandığı gibi soğuk önkoşullamanın dilim kültürler Açığa. Hasat dilim toplam protein tayini için kültürler. Yavaşça ucu ince bir fırça yer ve 1 ml soğuk kullanarak eklemek kapalı dilim (4 ° C) PBS. Kaldırın Santrifüj tüpleri ve dilim kültürlerin kapalı PBS kaldırmak. Kuru buz koyun hasadı bitinceye kadar. Mağaza tüpler -80 ° C Dilim bir total protein tayini gerçekleştirmek için kültür örnekleri homojenize edilir. Homojenizasyon için hücre lizis tamponu hazırlayın. Üreticinin talimatlarına (Bio-Rad) proteaz inhibitörleri, lizis tampon 5 ml ekleyin ve buz üzerinde bir kenara. Lizis tamponu, dilim kültürler ve ajitasyon dilim 100 mcL pipet ucu ile beş kez aşağı yukarı pipetleme ve Yeri 100 mcL 1 mm açık kesti. 4 ° C 'de 20 dakika süreyle plaka çalkalamalı örnekleri çalkalayınız. 4 15 dakika 13.000 rpm'de örnekleri Santrifüj ° C Temiz bir tüpe supernatant aktarın ve buz üzerinde bir kenara koyun. Total protein tahlil gerçekleştirin. Hazırlayın BSA (sığır serum albumin) protein standartları. Üreticinin talimatlarına göre ultra saf su ile sulandırın stok BSA. Lizis tamponu seyreltilmiş 0-1000 mg / mL arasında değişen protein standartları hazırlayın. Kiti talimatlarına göre gerekli çalışma reaktif hacmi hesaplayın. Örneğin, (sekiz standart + 18 bilinmeyen örnekleri) x (iki nüsha) x (numune başına 200 mcL çalışma reaktif) = 10.4 mL toplam hacmi 96 mikroplaka (örneğin, Microsphere akış sitometrik tahlil üzerine yüklemek için gerekli çalışma reaktif aşağıya bakınız). Karıştırma Reaktif Reaktif B, bazı bulanıklık meydana gelebilir, ama kısa zamanda kaybolur. Mikroplaka üzerine 10 standartlar ve numuneler mcL yükleyin. Kuyulara 0.2 mL çalışma reaktifi yükleyin. Mikroplak sızdırmazlık bandı ile örtün ve 30 saniye süreyle plaka çalkalayıcı sallamak. 37 inkübe mikroplak ° C de 30 dakika. 595 nm dalga boyunda bir plaka okuyucu okumadan önce oda sıcaklığına kadar soğumasını mikroplak (yaklaşık 10 dk). BSA standartları ölçülen absorbans ile Microsoft Excel kullanarak, standart bir eğri oluşturun. Standartları eğrisi elde edilen lineer denklem kullanarak örneklerinde protein konsantrasyonları hesaplayın. -80 Lizis tamponu ve mağaza ° C ile ölçülen en düşük konsantrasyon tüm örnekler sulandırınız # 12 ve 16 referans tam ayrıntılı olarak belirtildiği gibi tek karmaşık ve multipleks sitokin doku (veya sıvı) testleri gerçekleştirin. 12. İmmünohistokimya 10 ml% 16 paraformaldehid oluşan PLP fiksatif ile 24 saat boyunca kültürlerin Fix, 1.096 g lizin, 0.42 g sodyum fosfat, 0.17 g sodyum periyodat, toplam hacim 80 ml saf su (fiksatif pH 6.2) ile doldurulur. Biz PLP fiksatif aksi takdirde diğer fiksatif kullanarak belli olmaz düşük seviyeli İmmünoboyama algılama sağlayan yumuşak bir fiksatif olduğunu bulabilirsiniz. Kültürler 24 saat için sabit ve daha sonra PBS içeren sodyum azid (100 mg / L) ince bir fırça ile aktarılır. Aydınlık alan, yüzen bütün dilim kültürlerin immün ~ 50 rpm sallayarak akuple tüm adımları aşağıdaki gibi gerçekleştirilir. 10 dakika süreyle 3 mL PBS üç kez dilim kültürler yıkayın. % 0.3 H 2 O 2 dilim kültürler Quench. PBS içinde% 30 H 2 O 2 stok solüsyonu sulandırınız. Dilim kültürleri PBS üç kez, her biri 10 dakika yıkayın. 3 ml, 10 ml keçi serumu, 0.75 ml Triton X-100 ve 89.25 ml PBS oluşan bir altı plaka bloke çözüm, oda sıcaklığında bir saat dilim kültürler Blok. Serum engelleme çözümü için ikincil antikor büyüdü aynı türün gelmelidir. 4 engelleme çözümü seyreltilmiş primer antikor gecede dilim kültürleri ° C inkübe Küçük cam Pyrex çanak kuyuları için birincil antikor çözüm maksimum hacmi 0.3 ml daha yüksek hacimli plaka kenar üzerinde çalıştırmak eğilimindedir olmalıdır. Nemlendirilmiş bir kapalı bir kap yemeğin yerleştirin. Bölümler üstteki film üzerine döndü ve ileri tetkikleri için kayıp olabilir bu yana yapışık film ile çanak kapatmayın. Sadece yeterince yüksek antikor çözüm dilim dolaşmaya plaka çalkalayıcı hızı sallayarak ayarlayın. Cam levha dilim çıkarın ve yıkama başına 10 dakika PBS içinde üç kez yıkayın. Sallayarak ise sekonder antikoru dilimleri bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 0.3 ml ikincil antikor çözüm yük küçük cam Pyrex yemekleri kullanın. PBS, Yıkama başına 10 dakika içinde üç kez yıkayın. 3'-diaminobenzidin (DAB) ile boyanarak gözünüzde canlandırın. 3 ml dimetil sülfoksit 30 mg DAB çözülür. Filtre DAB 54 ml PBS ile iki # 1 filtre kağıtları ve yıkama. Kullanımdan hemen önce,% 30 H 2 O 2 20 mcL ekleyin. Kültürler DAB çözümü için oda sıcaklığında 5-7 dakika inkübe edin. Not: DAB kanserojen ve düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir. Belirgin bir kap içinde bir davlumbaz saklanan tüm DAB çözümleri atın ve çamaşır suyu DAB devre dışı bırakmak için tüm yemekler. Tüm DAB çözümler sonuçta Kurumsal Güvenliği Ofisi aracılığıyla atılmalıdır. Dilim kültürlerin her biri için 10 dakika PBS üç kez yıkayın. Jelatin Islak monte dilim kültürleri (ya da silan) distile su içinde çözünmüş 100 mcL bulaşık sabunu ile kaplı slaytlar. Gece boyunca oda sıcaklığında kurutun. Slayt ısıtıcıları aşırı ısı kullanmaktan kaçının slaytlara monte kültürleri içinde çatlaklara neden olabilir. Her biri 30 saniye için bir dizi dereceli etanol (50, 75, 95, 95, 100,% 100) ile slaytlar dehydrate. Sifresiz slaytlar, her biri için on dakika ksilen dört kez. Bir bardak Pasteur pipeti, yer 0.1 mL slayt üstüne montaj medya ve yavaşça oluşturan hava kabarcıklarını önlemek için lamel kullanma. Gece boyunca oda sıcaklığında kurutun. Floresan immün. Bölüm dilim kültürleri Kriyostat kullanılarak 20 mm kalınlığında. ° C iç sıcaklık ve -12 ° C objenin sıcaklığı -16 ila Kriyostat ayarlarını yapın. Pasteur pipeti ve kuru buz üzerinde dondurma ile küçük bir miktar metal mandren su koyun. Doku-Tek medya dondurulmuş aynanın üstüne ince bir disk tabaka uygulayın. Chuck dondurmak ve Kriyostat oda sıcaklığına denge sağlaması için izin verin. Bölüm Doku Tek medya, düz dilim kültürleri döşeme için uygun bir basık yüzey oluşturmak için. Bu kesit mandreni düşme montaj medya önleyecektir kesit için tutarlı bir açı sağlarken aynanın yönünü unutmayın. Dondurulmuş, ayna ve bir tutucu yer alır. Spatula üzerine metal bir spatula ve ucu ince bir boya fırçası kullanarak, bir kesit kültürü üzerinde slayt ve transferimandreni Doku Tek medya düzleştirilmiş tabakasının ortasında. En az 10 dakika süreyle oda sıcaklığında monte dilim kültür ve donma üzerinde ince bir tabaka Doku-Tek medya yerleştirin. "Trim" düğmesi etkinleşir, kesit kesit kültürü kadar Doku-Tek medya üst katmanları görünür. 20 mikron "bölümünde" önceden belirlenmiş "Döşeme" adresinden açın. Gece boyunca oda sıcaklığında ve kuru slaytlar jelatin kaplı slaytlar ile 20 mikron bölümden Pick-up. Doku-Tek medya slaytlar üzerinde görünür, ama PBS yıkar çözünür. Immün. Slaytların her biri 10 dakika PBS üç kez yıkayın. % 0.3 sallayarak 15 dakika oda sıcaklığında H 2 O 2, Quench. Slaytların her biri 10 dakika PBS üç kez yıkayın. SFX sinyal arttırıcı kullanarak, slayt ve nemlendirilmiş bir odasında oda sıcaklığında 30 dakika inkübe bölümler üstünde bir doğrudan Bileşen birkaç damla uygulanır. Bileşen ile Kuluçka parlak bir alan immünohistokimya yapılan% 10 keçi serumu çözüm engelleme adım değiştirir. Primer antikor inkübe slaytlar 0.75% 37 az iki saat PBS Triton X-100 ° C seyreltilmiş Slayt top doğrudan birincil antikor çözümü uygulamak ve buharlaşmasını önlemek için nemlendirilmelidir odasında inkübe. Sadece PBS ve Triton X-100 herhangi bir antikor çözümleri serum dahil etmeyin. Slaytların her biri 10 dakika PBS üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında bir saat için sekonder antikoru inkübe ve slaytlar ışıktan korumak. Antikor çözümü biniyorlar herhangi bir agrega önlemek için 20 dakika süreyle tüm floresan sekonder antikor santrifüjleyin. PBS içinde Triton X-100 0.75% kullanarak antikor dilüsyonları hazırlayın. Slaytların her biri 10 dakika PBS üç kez yıkayın. Dip, PBS ile tuzları yıkayın kez distile su slaytlar. Kuru slaytlar, oda sıcaklığında bir gece ışıktan uzak kaplanmıştır. Lamel Antifade medya uzatmak slaytlar. 5-10 sn için mikrodalga çözülme Bileşen A ve B. çözüm içine hava kabarcıkları tanıtmak için değil, dikkatli olmak Pastuer pipet kullanarak karıştırın Bileşeni bir şişe yaklaşık 1 ml ekleyin. Kabarcıkları maksimum hızda 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Dikkatli bir Pastuer pipet kullanarak slayt herhangi bir hava kabarcıklarının oluşmasını engellemek amacıyla üst uzatmak medya ince bir tabaka uygulayın. Işıktan uzak kapalı ve kuru bir gecede slayt üst kapak kayma, yavaşça yerleştirin. Çift-etiket floresan immün (Şekil 5). Hem primer antikorlar aynı inkübasyon çözümü sulandırmak dışında, yukarıda açıklandığı gibi floresan immün gerçekleştirin. Aynı çözüm tüm ikincil antikorlar seyreltilir ve yukarıda açıklandığı gibi kuluçkaya yatmaktadır. Iki antikor kullanarak Seri inkübasyon süreleri azalmış immün sonuçlandı. 13. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1. Hipokampal dilim kültürler ve mikroglia görünüm sol taraftan görüntü tipik bir olgun (yani, in vitro olarak 21 gün) hipokampal kesit kültürü temel nöronların hücre mimarisini göstermek için Neun (yeşil) ile leke gösterir. Piramidal nöronlar CA1 ve CA3 ve çöküntü alanları gösterilmiştirsol girus (DG) nöronların yedik. Ölçek çubuğu 250 mm. Sağ el görüntü CA1 alan türetilmiştir ve olgun dilim kültürleri içinde latent mikroglia dallı kalitesini göstermek için yüksek güçte gösterilir. Hücreler, CD11b mikrogliyal yüzey işaretleyici ile işaretlenmiş. Ölçek çubuğu 50 mm. Şekil 2. Soğuk önkoşullamanın hipokampal dilim kültürlerde nöro. Kültürler Sytox Yeşil, floresan işaretli ölü hücre belirteci ile inkübe edilir. Üst satırındaki sahte kontrol kültürleri ve alt sıra 28 ° C'de 90 dakika süreyle maruz dilimleri gösterir. Sol taraftan, ön-ekran görüntüleri CA1 yaralanma göstermektedir. Bağıl yaralanma renk kalibrasyonu ölçek sol üst görüntü gösterilmiştir. Orta satır görüntüler 20 mcM NMDA maruz kaldıktan sonra 24 saat göreceli dilim kültür yaralanma göstermektedir. Sahte kontrolü yaralanma, soğuk önkoşullamanın (CP) maruz kültürlerin daha büyük olduğuna dikkat edin. Geleneksel olarak, kültürler, ardından CA1 nöronal yaralanma seviyeleri ve CP v. sahte göreceli yaralanma en üst düzeye çıkarmak için gece NMDA 20 mcM maruz yaralanma / maksimum yaralanma oranı olarak dikkat çekti. Ancak, maksimum yaralanma uyaranlara maruz önkoşullamanın nöro üstesinden gelmek için yeterli olmayabilir. Buna göre, doğru önkoşullamanın nöro yansıtmıyor olabilir yaralanma / maksimum yaralanma oranlarının kullanın. Bu CP maksimum düzeyleri sham denetimleri dışında az göstermek sağ eli görüntüler açıktır. Şekil 3. Şematik yaralanma düzeyini ölçmek için ilk, ilk gün ölçümleri kullanarak yardımcı programı gösteren soğuk önkoşullamanın deneyler. Yukarıda da belirtildiği gibi, soğuk ön şartlandırma nöro gizleyebilecek oranları (yaralanma / maksimum yaralanma) kullanımının bulundu. Bu şematik sahte yaralanma kırmızı gösterilen sol ve görülebileceği sonra mavi soğuk önkoşullamanın. Bir gün NMDA maruz kaldıktan sonra soğuk önkoşullamanın yaralanma v. sahte ("5") kontrol% 40 nöro ile tutarlı bir akrabası, "3" düzeyi gösterir. Bununla birlikte, oranları (yani, yaralanma / maksimum yaralanma) kullanarak geleneksel bir biçimde kullanıldığı takdirde, herhangi bir koruma açıktır [yani soğuk önkoşullamanın, (5 / 10) =% 50 sahte v. (3 / 6) =% 50 ]. Şekil 4. Typial qPCR sonucu gösterilmiştir. Üst eğri kontrolleri (mavi) ve deneysel örnekleri (kırmızı) gösteren PCR RNA kopya sayısı v. eşik döngüsü. Düşük görüntü dört örnekleri (siyah, yeşil, sarı ve mor) için tipik amplifikasyon profilleri gösterir. İkinci Ct eşik döngüleri (turuncu çizgi ile işaretli), 26.0 29.5, 31.0 ve 32.5 meydana dikkat edin. Şekil 5. Çift-etiket immün qPCR ve qPCR dizi sonuçlarını onaylamak için kullanılan bir kesit kültürü, IL-11 (kırmızı) ve Neun (yeşil; işareti nöronlar) işlendi IL-11 hücresel ifade lokusların prob . Astrositler olduğu tahmin birkaç küçük hücreleri (oklar), gösterirken, bazı piramidal nöronlar (oklar), IL-11 ve Neun boyama (sarı) dikkat edin, sadece IL-11 boyama (kırmızı) artmıştır.