Rechtop beeldvorming van Drosophila Embryo's

1. Imaging Methodologie Gelei Smelt glycerine in een 55 ° C graden waterbad gedurende 20-30 minuten tot het een homogene vloeistof. Swirl, doe maar niet schudden de fles om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Terwijl de gelei smelt, breng een dunne laag van glycerol met behulp van een Kimwipe op een schoon glasplaatje (optioneel). Pipetteer 1 tot 1,5 ml gesmolten glycerine gelei met behulp van een cut P1000 pipettip op het oppervlak van de dia om een ​​dunne eerste laag te creëren. Pipet voorzichtig om luchtbellen te vermijden. Laat de gelei stollen gedurende 5 minuten op een horizontaal oppervlak, dan is de schuif plaats bij -20 ° C gedurende 5 minuten en ga verder met embryo uitlijning. U kunt ook betrekking hebben op de dia met Saran Wrap en plaats deze bij 4 ° C gedurende maximaal 5 dagen. Pipetteer een kleine druppel gekleurd embryo's in 70% glycerol / PBS of andere antifade glycerol-based montage media (bijvoorbeeld Slowfade of Vectashield) aan de zijde van de gelei beddengoed. Begin pre-embryo's door het afstemmen van de individueel over te dragen van de drop naar de gelei oppervlak. Overbrengen met behulp van een schuine injectienaald, het gebruik van de schuine zijde als een lepel. Ruwweg plaats van de embryo's langs de 2 tot 3 kolommen. Als een embryo vast komt te zitten in de naald, roer het in de druppel die de andere embryo's om deze los. Verspil geen tijd zorgvuldig uitlijnen hen op dit punt. Laat wat ruimte tussen de kolommen. Lijn de embryo's door ze horizontaal op de gelei medium met behulp van de injectienaald. Tijdens het glijden, oriënteren de koppen en staarten in dezelfde richting. Maak ze parallel aan elkaar langs de kolom. Verwijder overtollig van PBS glycerol links als een parcours met een stukje gedraaid Kimiwipe. Let op: Excess glycerol zal leiden tot embryo's te losjes verpakt binnen gel, wat resulteert in scheiding van de twee gelei lagen, waardoor het moeilijk om te knippen en te monteren. Omgekeerd zal het verwijderen van te veel glycerol droog en plat embryo's. Gebruik een afgezaagd geel tip om een ​​dun laagje gelei verspreid over de embryo's (50-150 pi, afhankelijk van hoeveel waren uitgelijnd). Plaats dia in -20 ° C vriezer voor 10-20 min. of bewaar deze bij 4 ° C gedurende de nacht. Zorg ervoor dat de gelei is helemaal stijf voor het snijden. Anders zal het blok van de embryo's zeer moeilijk te accijnzen. De beste resultaten voor het snijden worden verkregen op de volgende dag. Onder een ontleding bereik, gebruik dan een scheermesje om volledig dwars door de gelei op beide zijden van de lijn embryo's. Houd het scheermesje in een hoek van 90 ° rechte zaagsneden te maken. De bezuinigingen moeten worden gemaakt zeer dicht bij de voorste en achterste polen van de embryo's om overtollige gelei die kunnen belemmeren beeldvorming te voorkomen. Voeg 100 tot 200 ul van koude PBT (4 ° C, PBS +0,1% Tween 20) naast de bezuinigingen en voorzichtig afschrapen van de gelei tussen embryo's met behulp van een spatel. Opmerking: Het wasmiddel in PBT helpt bij het verwijderen van de gelei van de dia zonder beschadiging van de embryo's. Met behulp van een naald, de overdracht het blok van de gelei met embedded embryo's op een schoon objectglas voor verdere snijden. Gesneden kleinere blokken met 5-7 embryo's. Gebruik PBT om gemakkelijk te verplaatsen rond de gelei blok. Als alternatief, plaats het blok op een droge ondergrond te laten hechten aan het glas, waardoor meer stabiliteit voor het precies trimmen van de gelei, indien nodig, creëert. Flip rechtop de embryo's ingebed in de gelei met behulp van een scheermesje en een naald. Voor visualisatie onder de microscoop, ga dan verder met een van de twee onderstaande stappen, afhankelijk van het type microscoop stand wordt gebruikt. Omkeermicroscoop: plaats embryo blokken afgewerkt op een lange dekglaasje, met embryo's in een rechtopstaande positie. Zorg ervoor dat de zijde van het embryo met de minste hoeveelheid gelei zal in nauwer contact met de doelstelling. Rechtop microscoop: maak twee stapels met vier # 1 coverslips gelijmd met superlijm om gebruikt te worden als "ondersteunt", en het embryo blok in glycerol plaats in tussen de "ondersteunt". Brug de stapels met behulp van een lange dekglaasje aan. Voor de confocale analyse, controleer dan de werkafstand van de doelstellingen die moeten worden gebruikt om te achterhalen of u foto helemaal door het embryo of slechts gedeeltelijk. Bijvoorbeeld, D. melanogaster embryo's ~ 0,55 mm in lengte en kan volledig worden afgebeeld met behulp van een Zeiss 20x Plan-Apo of een 40x LD Neo-Fluor doelstelling. De volgende website is informatie over de beschikbare Zeiss doelstellingen en geeft u de mogelijkheid om doelstellingen te zoeken op werkafstanden: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php 2. Representatieve resultaten Omdat het embryo intact worden gelaten, kan deze methode worden gebruikt om nauwkeurige metingen van embryo grootte en afstanden tussen de genexpressie patronen te nemen. In figuur 1 geven we een blastoderm stadium embryo's gekleurd met de nucleaire vlek DAPI (blauw), anti-Dorsale eiwit (rood), SOG mRNA (geel) en SNA mRNA (groen). Morfologische processes, kan zoals invaginatie van het mesoderm (Figuur 2A, B) en migratie van mesodermale cellen (Figuur 3 en 4) ook worden gevisualiseerd met behulp van deze methode. Verschillende Z-posities langs de DV-as kan worden verkregen door het veranderen van de focal plane, zoals weergegeven in de figuren 2-4. Figuur 1. Rechtop optische schijfje van een intacte embryo in blastoderm stadium. Dubbelklik kleuring voor mRNA en eiwit. Doelwit mRNA's voor in-situ sondes (SOG en SNA) en eiwit gekleurd door primaire antilichaam (anti-Dorsale) zijn aangegeven in de figuur. DAPI werd gebruikt om de kernen label. Merk op dat de uitdrukking van SOG en SNA apicaal bevinden zich in het cytoplasma, terwijl de uitdrukking van Dorsale is kernenergie. Sterke signalen van SOG ontluikende transcripten die zich bevinden in de kernen is ook te zien op deze vergroting. Figuur 2. Rechtop beeldvorming van een intacte gastrulating embryo. MRNA probes gebruikt en de bijbehorende kleuren zijn aangegeven in de figuur. A) Merk op dat in dit stadium, drie genen gekleurd met dezelfde Fluor (SNA, SOG en DPP, in het groen), worden uitgedrukt in ruimtelijk gescheiden domeinen. De invaginating mesoderm drukt SNA, de neuroblast laag drukt IND en het ectoderm uitdrukt DPP, terwijl de SOG uitdrukking is nog steeds aanwezig in ventrale regio's van het zenuwstelsel. B) In een diepere confocale vliegtuig van hetzelfde embryo, merken we de basis van het invaginating mesoderm sterk tot uitdrukking SNA, maar de apicale regio uitdrukt lagere niveaus. Figuur 3. Rechtop beeldvorming van een intacte embryo met een kiem band uitgebreid SOG RNA (geel);. Slak, IND en DPP mRNAs (groen), Dorsale eiwit (rood). Kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). A) Focal plane in de buurt van embryo hoofd. B) Een ander focal plane in de kofferbak regio van hetzelfde embryo. Let op de massa van mesodermale cellen voordat laterale migratie (te vergelijken met 4 figuur) liggen dicht bij de ventrale middellijn aan beide zijden van een kiem-band uitgebreid embryo. Delamineren neuroblasts zijn geëtiketteerd in groen (IND en SNA). Figuur 4. Rechtop beeldvorming van een intacte embryo tijdens de kiem band extensie SOG RNA (geel);. Slak, IND en DPP mRNAs (groen), Dorsale eiwit (rood). A) Let op de delamineren neuroblasts van het epitheel (pijl), gebeitst zowel voor de IND en SNA in dit stadium (groen). Let ook op de beperkte uitdrukking van SOG aan de ventrale middellijn (geel). Expressie van DPP in dit stadium te zien op zijkanten van het embryo (asterisk). B) Optische gedeelte in dezelfde embryo getoond in A aan het einde van het embryo lengte, die overeenkomt met mid-posterior regio. Het ventrale middellijn cellen zijn gekleurd voor SOG.