Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten

Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) für die Identifizierung und Analyse von Multiproteinkomplexen: ** Dieses Video-Protokoll basiert auf einem zugehörigen Publikation 1. Mahima Swamy, Gabrielle M. Siegers, Susana Minguet, Bernd Wollscheid, und Wolfgang WA Schamel. Science STKE 2006 (345): pl2, 25. Juli 2006, [DOI: 10.1126/stke.3892006pl4]. Bitte klicken Sie hier, um diese Publikation zu sehen . 1. Vorbereitung der dialysiert Zelllysat Ernte 10×10 6 Zellen und Pellet durch Zentrifugation bei 350g für 5 min bei 4 ° C. Waschen Sie die Zellpellet dreimal mit 1 ml eiskaltem PBS (Rezept 1), in Schritt 1.1 Zentrifuge. Pellet in 250 ul eiskaltem BN-Lysis Buffer (Rezept 2) und auf Eis inkubieren für 15 min. Zentrifuge bei 13.000 g für 15 min bei 4 ° C zu entfernen unlösliches Material. Melt ein Loch in den Deckel eines 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit der beheizten großen Durchmessers Seite einer Pasteurpipette dann die Röhrchen auf Eis abkühlen auf 4 ° C. Überstand aus Schritt 1.4 in den gekühlten Rohr mit dem Loch in der Kappe. Legen Sie eine Dialysemembran (molecular weight cut-off von 10 kD) mit einer Pinzette auf der Oberseite des geöffneten Röhre, in der Nähe der Kappe, und schneiden Sie das überschüssige Dialysemembran, die aus Stöcken. Seal die Kappe auf der Seite sorgfältig mit Parafilm. Kehren Sie die Rohre und Zentrifuge Upside-Down zu den niedrigsten möglichen Geschwindigkeit in einer 50-ml konische Röhrchen in einer Zellkultur Zentrifuge für 10 sec bei 4 ° C. Entfernen Sie den invertierten Rohr aus der Zentrifuge mit einer Pinzette zu vermeiden, drehen die Röhre wieder richtig herum. Bereiten Sie eine 100-ml-Becher mit kaltem BN-Dialyse-Puffer (Rezept 3) und einer Rührplatte. Verwenden Sie mindestens 10 ml BN-Dialyse-Puffer pro 100-ul-Probe. Befestigen Sie das Rohr mit Klebeband auf den Kopf in den Becher, und entfernen Sie Luftblasen aus dem Loch unter der Kappe mit einem gebogenen Pasteurpipette. Legen Sie Becherglas auf einem Magnetrührer auf der Rührer-Schalter und lassen Sie es für 6 Stunden oder über Nacht im Kühlraum. Überprüfen Sie gelegentlich, um sicherzustellen, dass das Rühren nicht schaffen Luftblasen an der Dialysemembran. Sammeln Sie die dialysiert Zelllysat in ein neues gekühltes Reaktionsgefäß. 2. Gießen von BN-Gelen Gradient Gel gegossen wird bei Raumtemperatur mit einem Gradienten-Mischer erfolgen. Handschuhe müssen getragen, weil Polyacrylamid ist ein starkes Nervengift werden. Vermeiden Sie jeden Kontakt mit SDS. Legen Sie die Gradientenmischer auf einer Rührplatte und hängen Sie es an einem Stück Schlauch. Schließen Sie den Kanal mit dem Ventil und schließen Sie den Schlauch mit einer Schelle. Legen Sie einen Magnetrührer 15% in den "high" Zylinder verbunden, um den Schlauch. Thema der flexiblen in eine peristalitic Pumpe und befestigen Sie eine Kanüle bis zu seinem Ende. Dann setzen Sie die Nadel zwischen den beiden Glasplatten der Gel-Apparatur. Bereiten Sie 4% (Rezept 5) und 15% (Rezept 6) Trenngel-Lösungen, indem APS und TEMED erst unmittelbar vor Gebrauch. Das kombinierte Volumen gleich sein sollten, um die Lautstärke des Trenngels. Gießen Sie diese Gel-Lösungen in die entsprechenden Zylinder des Gradientenmischer (4% in den "low" und 15% in den "high" Zylinder). Öffnen Sie das Ventil und Kraft aus der Luftblase im Inneren des Kanals zwischen den beiden Stauseen Gel, indem Sie über die linke Zylinder mit dem Daumen. Schalten Sie den Magnetrührer, entfernen Sie die Klemme, und schalten Sie die Pumpe peristalitic bis 5 ml pro Minute. Lassen Sie das Gel langsam zwischen den Glasplatten fließen. Stellen Sie sicher, dass die Nadel immer oberhalb der Flüssigkeit. Lassen Sie alle flüssigen in den Gel-Apparatur geben, und dann sanft Überlagerung mit Isopropanol. Lassen Sie das Gel für mindestens 30 min bei Raumtemperatur polymerisieren. Reinigen Sie das Gießen Apparat sofort mit dH 2 O (Verwenden Sie keine Reinigungsmittel). Entfernen Sie die Isopropanol, mit dH 2 O gewaschen, und entfernen Sie die dH 2 O mit einem Whatman-Papier. Bereiten Sie eine 3,2% Sammelgel (Rezept 7) und fügte hinzu, APS und TEMED erst unmittelbar vor Gebrauch. Gießen Sie die Stacking-Gel auf dem Trenngel und stellen Sie den Kamm zwischen den Glasplatten, blasenfrei. Nach dem Stapeln Gel polymerisiert, kühlen das Gel bis zu 4 ° C. Unmittelbar vor der Probenaufgabe, entfernen Sie den Kamm langsam und zog sie in einem Winkel zur Ebene des Gels. Dadurch kann Luft in die Taschen schnell, was die Qualität des Brunnen verbessert geben. 3. Trennung von dialysiert Zelllysat durch BN-PAGE Laden von 1 bis 40 ul der dialysiert Lysat und 10 bis 20 ul der Marker-Mix (Rezept 10) in den trockenen Brunnen bei 4 ° C. Overlay die Proben in jede Vertiefung mit Kaltkathoden-Buffer (Rezept 8). Füllen Sie den Innenraum mit kaltem Cathode Buffer und der äußeren / unteren Kammer mit kaltem Anode Buffer (Rezept 9). Apply 100 V eine Minigel oder 150V zu einer großen Gel, bis die Proben das Trenngel eingegeben haben. Führen Sie das Gel bei 4 ° C. Erhöhen Sie die Spannung auf 180 V (Minigel) oder 400 V (large-Gel) und führen bis der Farbstoff vor Erreichen des Endes des Gels. Der Lauf dauert 3 bis 4 Stunden für ein Mini-und 18 bis 24 Stunden für ein großes Gel. 4. Zweite Dimension SDS-PAGE Bereiten Sie eine Standard-10% SDS-Gel (Rezepte 12-15) mit einer einzigen großen Spur für die erste Dimension BN-PAGE Spur, eine reguläre Fahrspur für den Molekulargewichtsmarker, und eine regelmäßige Spur für eine Teilmenge der dialysierten Lysat, dass hat wurden mit SDS-Probenpuffer (Rezept 11) gemischt und für 5 min gekocht bei 95 ° C. Verwenden Sie Abstandshalter, deren Dicke wurde durch zwei Lagen Klebeband erhöht werden, um Belastung der BN-PAGE-Gel Scheibe auf das SDS-Gel zu vereinfachen. Entfernen Sie die BN-PAGE-Gel in die Platten aus dem Elektrophorese-Vorrichtung und hebeln bis eine Platte. Entfernen Sie die Stacking-Gel und schneiden Sie die Spur der BN-PAGE-Gel mit den Proteinen von Interesse. Legen Sie die BN-PAGE-Gel Scheibe in 2x SDS-Probenpuffer und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. Kochen Sie die BN-PAGE-Gel Scheibe kurz (nicht mehr als 20 sec) in eine Mikrowelle. Inkubieren Sie die BN-PAGE-Gel Scheibe in die heiße SDS Probenpuffer für weitere 15 min bei Raumtemperatur. Laden Sie die BN-PAGE-Gel Scheibe in den großen, gut über die Stacking-Gel der SDS-PAGE-Gel luftblasenfrei und überziehe die Scheibe mit SDS-Probenpuffer. Legen Sie Marker und Lysat zu kontrollieren. Führen Elektrophorese nach Standardprotokollen. 5. Erkennung von MPC-Untereinheiten durch Immunoblots Für die Übertragung, Bereiten Sie sechs Whatman Papiere und eine PVDF-Membran Anpassung an die Größe des SDS-Gels. Inkubieren Sie die PVDF-Membran in 100% Methanol für 30 s und genießen die Whatman Papiere in Transfer-Puffer (Rezept 16). Platzieren Sie drei Whatman Papiere, die PVDF-Membran, das SDS-Gel (entfernen Stacking-Gel), und wieder drei Whatman Papiere in einer Sandwich-Struktur in eine halbtrockenen Transfer Zelle. Übernehmen 20 V für 25 min. Detect Proteine ​​gemäß der Norm Immunoblot-Protokolle. 6. Repräsentative Ergebnisse Wir präsentieren die Analyse der eukaryotischen 19S, 20S und 26S Proteasomen als Beispiel für MPC Charakterisierung durch 2D BN / SDS-PAGE (Abbildung 1A). HEK293 Zellen wurden mit einem Puffer mit 0,1% lysiert Triton X-100 als Detergens um die Membranen zu stören und zu lösen Membranprotein-Komplexen. Diese Lysate wurden gegen BN-Dialyse-Puffer dialysiert, um Salze und kleinen Metaboliten zu entfernen. Dann wurden PLM nach 4-15% Steigung BN-PAGE durch eine zweite Dimension SDS-PAGE, gefolgt getrennt. Die Proteine ​​wurden durch Immunblot mit Antikörpern gegen die Untereinheiten β2 und Mcp21 des 20S Proteasom. Abbildung 1. Ein zweidimensionales BN-PAGE/SDS-PAGE Ansatz mit Zelllysaten. (A) Flow-Diagramm eines 2D BN-PAGE/SDS-PAGE Ansatz von Zelllysaten. (B) Schematische Schema einer 2D BN-PAGE/SDS-PAGE. Proteine ​​und MPC sind unter nativen Bedingungen durch BN-PAGE in einer ersten Dimension getrennt. Für die zweite Dimension, sind Proteine ​​und / oder MPCs denaturiert SDS im Gel Streifen nach der Trennung von BN-PAGE und anschließend einer SDS-PAGE unterzogen. Monomeren Proteinen wird in einem hyperbolischen diagonal durch die Gradienten-Gel in der ersten und eine lineare Gel in die zweite Dimension migriert. Komponenten eines konkreten MPC wird unterhalb der Diagonalen, auf einer vertikalen Linie befinden gefunden werden. Es hat sich gezeigt, dass durch die Kombination der ersten Dimension BN-und die zweite Dimension SDS-PAGE, monomere Proteine ​​innerhalb einer hyperbolischen diagonal durch die Gradienten-Gel wandern in der ersten und der linear-Gel in der zweiten Dimension ((Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004);. Abbildung 1B). Komponenten der Mittelmeer-Partnerländer sind unterhalb der Diagonale liegt. Proteine, die Untereinheiten des gleichen MPC darstellen kann in einer vertikalen Linie in der zweiten Dimension zu finden, während mehreren Stellen des gleichen Proteins in eine horizontale Linie das Vorhandensein des Proteins in mehrere verschiedene MPCs anzuzeigen. Abbildung 2 zeigt, dass in unserem Experiment Immunoblot gegen β2 und Mcp21 zeigte die Anwesenheit von spezifischen Protein-Komplexen mit diesen proteasomalen Untereinheiten. Beide Proteine ​​wurden als einzelne Punkte in einer horizontalen Linie angeordnet nachweisbar, was darauf hinweist, dass β2 und Mcp21 Bestandteile von mehreren verschiedenen MPC vertreten. Diese MPCs konnte eindeutig als das 26S Proteasom (20S und 19S-Cap), das 20S-Proteasom zusammen mit der regulatorischen Untereinheit PA28 identifiziert werden, und die 20S Proteasomen allein auf der Grundlage ihrer Größe und Zusammensetzung. Zusammengenommen sind diese results zeigen, dass endogene MPCs identifiziert werden können und durch eine zweidimensionale BN-PAGE/SDS-PAGE Ansatz mit Zelllysat charakterisiert werden. Dieses Verfahren ist anwendbar für die Bestimmung der Größe, Zusammensetzung und relative Häufigkeit von PLM. Abbildung 2. Erkennung von verschiedenen Formen der eukaryotischen Proteasom durch Immunoblot nach zweidimensionaler BN-PAGE/SDS-PAGE. Zur Identifizierung und Analyse von eukaryotischen Proteasom, wurden HEK293-Zellen mit 0,1% Triton X-100 lysiert. Zelllysaten wurden dialysiert und anschließend auf BN-PAGE (4-15%) zu trennen MPCs unterzogen. Danach wurde eine zweite Dimension SDS-PAGE (10%) für die Größe Trennung der einzelnen Subkomponenten laufen. Immunoblotting wurde mit spezifischen Antikörpern, die Mcp21 und β2-Untereinheit des 20S Core-Komplex und der regulatorischen Untereinheit PA28 durchgeführt. I. Tabelle der spezifischen Reagenzien (alphabetische Reihenfolge): Reagens Firma Kommentare 6-Aminohexansäure (Ε-Aminocapronsäure) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland Diese Chemikalie ist reizend und sollte mit Handschuhen angefasst werden. Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung (40%), Mix 32:1 Applichem, Darmstadt, Deutschland Diese Lösung ist neurotoxisch und sollten mit Handschuhen angefasst werden. Bis-Tris Roth, Karlsruhe, Germa-ny Brij 96 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland Coomassie-Blau G250 Serva, Heidelberg, Deutsch-land Verwenden Sie keine anderen Arten von Coomassie Farbstoff wie Coomassie Blau R250 oder kolloidalen Coo-Massie Blues. Digitonin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland Digitonin ist giftig. Die Handschuhe sollten bei der Handhabung Puffer oder Proben mit diesem abschrecken-gent werden. Dodecylmaltosid Applichem, Darmstadt, Deutschland Triton X-100 Roth, Karlsruhe, Germa-ny Triton X-100 ist giftig. Die Handschuhe sollten bei der Handhabung Puffer oder Proben mit diesem Reinigungsmittel gereinigt werden. II. Tabelle der spezifischen Material und Ausrüstung: Ausstattung Firma Dialysemembranen (molecular weight cut-off von 10 bis 50 kD) Roth, Karlsruhe, Deutschland Gel-Elektrophorese-System Zum Beispiel von Bio-Rad, München, Deutschland Gradientenmischer Self-made oder im Handel von Bio-Rad, München, Deutschland Schlauchpumpe Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran Immobilon-P, Millipore, Eschborn, Deutschland Semi-dry-Transfer- Zum Beispiel von Bio-Rad, München, Deutschland Silicon-Schlauch (3 bis 5 mm Durchmesser, 1 m Länge) NeoLab, Heidelberg, Deutschland III. Tabelle der Rezepte: Nein. Puffer und Lösungen Inhalt Kommentare 1 Phosphate-Buffered Saline (PBS) Na 2 HPO 4 8.1 MMKH 2 PO 4 1,5 mM NaCl 138 mM KCl 2,7 mM Lösung sollte pH 7,4 sein, wenn vorbereitet richtig. 2 BN-Lysispuffer Basis-Puffer Bis-Tris 20 mM ε-Aminocapronsäure 500 mM NaCl 20 mM EDTA, pH 8,0 2 mM Glycerin 10% Der pH-Wert auf 7,0 mit HCl. Lagerung bei 4 ° C. Reinigungsmittel Digitonin 0,5 bis 1,0% oder Brij 96 von 0,1 bis 0,5% oder Triton X-100 von 0,1 bis 0,5% oder Dodecylmaltosid 0,1 bis 0,5% Protease-und Phosphatase-Inhibitoren Aprotinin 10 pg / mL Leupeptin 10 pg / mL PMSF 1 mM Natriumfluorid 0,5 mM Natriumorthovanadat 0,5 mM Die entsprechenden Reinigungsmittel müssen empirisch ermittelt werden und sollte die gleiche wie die in den anderen Lysepuffer Rezepte verwendet werden. Digitonin muss unmittelbar vor Gebrauch aus einer 2%-Stammlösung in dH 2 O (store in 5-ml-Portionen bei -20 ° C) hinzugefügt werden. Protease und Phosphatase hemmen-ors sollte unmittelbar vor Gebrauch hinzugefügt werden. Nach Zugabe von Natrium-orthova-nadate, wird der Puffer zu gelblich. 3 BN-Dialysepuffer Basis-Puffer Bis-Tris 20 mM ε-Aminocapronsäure 500 mM NaCl 20 mM EDTA, pH 8,0 2 mM Glycerin 10% Der pH-Wert auf 7,0 mit HCl. Lagerung bei 4 ° C. Reinigungsmittel Digitonin 0,3 bis 0,5% oder Triton X-100 0,1% oder Brij 96 0,1% oder Dodecylmaltosid 0,1% Protease-und Phosphatase-Inhibitoren PMSF 1 mM Natriumorthovanadat 0,5 mM Die entsprechenden Reinigungsmittel müssen empirisch ermittelt werden und sollte die gleiche wie die in den anderen Lysepuffer verwendet werden, aber an der angegebenen unteren Konzentrationen. Waschmittel muss zu ver-hindern Aggregation auf Stapeln Schritt Gelelektrophorese hinzugefügt werden. Protease und Phosphatase hemmen-ors sollte unmittelbar vor Gebrauch hinzugefügt werden. 4 3x BN-Gel-Puffer Bis-Tris 150 mM ε-Aminocapronsäure 200 mM Der pH-Wert auf 7,0 mit HCl. Lagerung bei 4 ° C. 5 4% Trenngel 3x BN-Gel-Puffer (Rezept 4) 5,00 ml Acrylamid / Bisacrylamid 1.50 mL dH 2 O 8,50 mL APS, 10% in dH 2 O 54 ul TEMED 5,4 ul Add APS und TEMED unver-züglich vor dem Gießen-Gel, da diese Reagenzien zu fördern Polymerisation. Dieses Rezept ist ausreichend, um einen 30-ml-Gel gegossen. Lautstärkeanpassung für die Anzahl und Größe der Gele gegossen. 6 15% Trenngel 3x BN-Gel-Puffer (Rezept 4) 5,00 ml Acrylamid / Bisacrylamid 5,63 mL Glycerol 70% 4,38 mL APS, 10% in dH 2 O 42 ul TEMED 4,2 ul Add APS und TEMED unver-züglich vor dem Gießen-Gel, da diese Reagenzien zu fördern Polymerisation. Dieses Rezept ist ausreichend, um einen 30-ml-Gel gegossen. Lautstärkeanpassung für die Anzahl und Größe der Gele gegossen. Die Konzentration von Acrylamid-Bisacrylamid kann auch als notwendig, von 10 bis 18% variiert werden. 7 3,2% Stacking Gel 3x BN-Gel-Puffer (Rezept 4) 3.00 mL Acrylamid / Bisacrylamid 0,72 ml dH 2 O 5,28 mL APS, 10% in dH 2 O 120 ul TEMED 12 ul Add APS und TEMED unver-züglich vor dem Gießen-Gel, da diese Reagenzien zu fördern Polymerisation. Dieses Rezept ist ausreichend, um einen 30-ml-Gel gegossen. Lautstärkeanpassung für die Anzahl und Größe der Gele gegossen. 8 Cathode Buffer Bis-Tris 15 mM Tricine 50 mM Coomassie-Blau G250 0,02% Bereiten Sie 1 Liter als 10fach, pH-Wert auf 7,0 mit HCl, und lagern bei 4 ° C. Verdünnen 1:10 mit dH 2 O vor dem Gebrauch. Verwenden Sie keine anderen Arten von Coomassie Farbstoff wie Coomassie Blau R250 oder kolloidale Coomassie Blau. 9 Anodenpuffer Bis-Tris 50 mM Bereiten Sie 1 Liter als 10fach, pH-Wert auf 7,0 mit HCl, und lagern bei 4 ° C. Verdünnen 1:10 mit dH 2 O vor dem Gebrauch. 10 Marker Mix Aldolase (158 kD) 10 mg / mL Catalase (232 kD) 10 mg / mL Ferritin (440 und 880 kD) 10 mg / mL Thyreoglobulin (670 kD) 10 mg / mL BSA (66 und 132 kD) 10 mg / mL Bis-Tris 20 mM NaCl 20 mM Glycerin 10% Der pH-Wert auf 7,0 mit HCl. Lagerung bei 4 ° C. Molekulargewichtsmarker sind auch kommerziell erhältlich von verschiedenen Quellen, einschließlich Invitro-gen oder Pharmacia. 11 SDS-Probenpuffer Tris 12,5 mM SDS 4% Glycerin 20% Bromphenolblau 0,02% Der pH-Wert auf 6,8. Zur Reduzierung der Disulfidbrücken, fügen 9 mL β-Mercaptoethanol. SDS als Pulver und β-mer-captoethanol sind giftig. Verwenden Sie daher Handschuhe und arbeiten unter einer Haube. 12 4x unteren Puffer Tris 1,5 M SDS 0,4% Der pH-Wert auf 8,8. SDS als Pulver ist giftig. Verwenden Sie daher Handschuhe und arbeiten unter einer Haube. 13 4x oberen Puffer Tris 0,5 M SDS 0,4% Der pH-Wert auf 6,8. SDS als Pulver ist giftig. Verwenden Sie daher Handschuhe und arbeiten unter einer Haube. 14 10% Trenngel Acrylamid (30%) 2,0 mL 4x unteren Puffer 1,5 ml dH 2 O 2,454 mL APS, 10% in dH 2 O 40 ul TEMED 6 ul Add APS und TEMED unver-züglich vor dem Gießen-Gel, da diese Reagenzien zu fördern Polymerisation. Dieses Rezept ist ausreichend, um einen 30-ml-Gel gegossen. Lautstärkeanpassung für die Anzahl und Größe der Gele gegossen. 15 4,8% Stacking Gel Acrylamid (30%) 320 ul 4x oberen Puffer 500 ul dH 2 O 1,16 ml APS, 10% in dH 2 O 20 ul TEMED 2 ul Add APS und TEMED unver-züglich vor dem Gießen-Gel, da diese Reagenzien zu fördern Polymerisation. Dieses Rezept ist ausreichend, um einen 30-ml-Gel gegossen. Lautstärkeanpassung für die Anzahl und Größe der Gele gegossen. 16 Semidry Transfer-Buffer Tris 48 mm Glycine 39 mM Methanol 20% SDS 0,1% Anpassen der Lautstärke auf 1 Liter mit dH 2 O. Lagerung bei Raumtemperatur. SDS als Pulver und Methanol sind giftig. Verwenden Sie daher Handschuhe und arbeiten unter einer Haube.