Cinematica e di reazione Determinazione terra Force: Un Quantificazione Abilità Dimostrazione Locomotore di Giovane adulto, mezza età, e Ratti geriatrica

1. Pre-requisiti per l'analisi biomeccanica della locomozione Prima di intraprendere l'acquisto di costose apparecchiature di analisi locomotore, e di pianificazione di esperimenti in cui cinematica e / o valutazione locomotore cinetica verrà eseguita, è imperativo che lo sperimentatore avere familiarità con gli aspetti tecnici e pratici di analisi biomeccanica, il comportamento sensomotorio, condizionamento operante di animali , e la gestione / archiviazione / gestione di grandi quantità di dati digitalizzati. Sebbene questi pre-requisiti sembrare ovvio a molti, è solo dopo intraprendere questo tipo di esperimenti in cui i tirocinanti realizzare la complessità tecnica e pratica di effettuare analisi dettagliate relativamente locomotore. Gli autori raccomandano che gli sperimentatori iscriversi ad un corso introduttivo si occupano di biomeccanica, avere familiarità con o assumere qualcuno conosce un linguaggio di programmazione necessarie per la gestione dei dati, e di pari importanza, trascorrono interagendo notevole tempo, la manipolazione, e lavorare con gli animali da laboratorio. Per comprendere l'analisi della locomozione e di analisi del comportamento sensomotorio nelle neuroscienze, gli sperimentatori sono indicati alcuni riferimenti importanti (vedi 1, 4-7). 2. Apparecchi di prova cinematiche e cinetiche Un apparato di test cinematica e dinamica, utile per la raccolta dei dati bilaterale, è composto dai seguenti componenti (vedi "Tabella di reagenti e attrezzature specifiche" per maggiori dettagli): Stanza tranquilla e sufficientemente imprese (non necessariamente insonorizzate, anche se situato in zona a basso traffico) Radio per la fornitura di sottofondo "rumore" per limitare i rumori distraggono dall'esterno della sala per gli animali Plexiglass trasparente, chiuso, piatto superficie della pista (180 cm X 20 cm di larghezza x 60 cm di altezza) con un foro quadrato (11 cm X 11 cm) situato all'interno del centro della pista equidistante da entrambe le estremità Pezzo di plexi-glass (10,5 cm X 10,5 cm) Nastro biadesivo scotch adesivo Riflettente 3M nastro adesivo per i marcatori della pelle Foratura per la creazione di marcatori della pelle Macchina per anestesia Isofluorane necessari per anestetizzare gli animali per la rasatura prima del posizionamento dei marcatori della pelle Cheerios per incoraggiare il movimento dell'animale per tutta la lunghezza della pista AMTI HE6X6 forceplate Vicon Motus sistema personalizzato (software, computer, ecc) 4 telecamere (almeno 60 Hz di campionamento) e treppiedi con cavi connettore appropriato 4 telecamere montate lampade alogene fornisce un'illuminazione ottimale per l'illuminazione del soggetto animali e la pelle marcatori riflettenti Appropriata cornice di taratura standard o volume necessario per il sistema Vicon Motus per calibrare x, y, z in posizioni significative misure di distanza 3. Formazione degli animali Prima della raccolta dei dati, ogni animale deve essere addestrato per attraversare una superficie piatta, pista chiusa. Dopo aver ricevuto i ratti da un fornitore animale appropriato, gli animali dovrebbero essere acclimatati alla loro nuova casa per 1 settimana. Durante questo periodo di acclimatazione, Cheerios diversi vengono inseriti ogni giorno nella gabbia del ratto. Gli animali sono cibo limitato a interventi di manutenzione la loro energia per prevenire l'obesità e assicurare la motivazione per svolgere questo compito. Successivamente, ogni animale viene gestita dallo sperimentatore per 10-15 minuti al giorno per 1 settimana. Durante questo stesso periodo di tempo, ogni animale viene messo in pista con Cheerios situati alle due estremità. Una volta che l'animale diventa familiarità con l'ambiente, inizieranno a mangiare i Cheerios. Una volta che l'animale sta bene e Cheerios mangiare all'interno della pista, lo sperimentatore deve poi operantly condizione l'animale a correre la lunghezza della pista per una ricompensa in cibo. Ciò si ottiene lanciando ciao ¼ al lato opposto della pista dove è posizionato il topo. Una volta che il topo mangia questo ciao, ciao un altro ¼ è posta all'altra estremità della pista. Questo viene fatto per 15-20 minuti al giorno fino a quando il ratto consistente (> 90% di lanci) si muove lungo la pista ad una velocità costante (cioè senza avviamento, arresto, esplorare, o senza cambiare andatura) a mangiare i ciao senza galoppo / delimitazione . Il ratto dovrebbe essere solo impiegando una andatura al trotto. Over-condizionamento degli animali a questo compito può portare agli animali al galoppo e delimitazione queste andature sono indicativi di animali viaggiare> 90 cm / s. Delimitazione e galoppo andature, biomeccanico, sono più difficili da interpretare per vari motivi (ad esempio gamba criteri di inclusione di piombo, ecc.) Nella nostra esperienza, una volta che i ratti costantemente impiegare al galoppo o di delimitazione andature, è difficile, se non impossibile averli utilizzare un andatura al trotto, mentre locomoting in pista. Velocità> 90 cm / s sono raramente osservati dopo un animale ha sofferto periferico o centrale lesioni del sistema nervoso. Tempo per raggiungere la formazione di successo è VariaBLE tra i sessi e ceppi di ratti. Wistar, Lewis, Long-Evans, e Sprague-Dawley ceppi sono in grado di attraversare sempre la pista entro 2 settimane dall'inizio della formazione 8. Nella nostra esperienza, Fischer (F-344) ratti tendono ad assumere verso l'alto di 4-6 settimane per imparare questo compito 8. 4. Posizione comune Marcatura Analisi cinematica degli arti anteriori è inaffidabile a causa di artefatti pelle movimento imposte mettendo marcatori pelle degli arti anteriori, che è aggravata in specie, come i topi, che hanno una postura accovacciata 9. Invece, la cinematica degli arti anteriori deve essere realizzato utilizzando raggi X cinematografia o la fluoroscopia 10-13. Come tale, degli arti posteriori congiunta posizionamento indicatore di posizione è solo qui descritti. Prima della raccolta dei dati, ogni topo deve essere anestetizzato almeno 24 ore prima della raccolta dei dati utilizzando un apposito anestetico inalatorio (ad es isofluorane, 1,5-2% composti su un vaporizor precisione) e amministrato in ossigeno tramite maschera facciale, e la chiave anatomica topografica punti di riferimento devono essere contrassegnati. Data la brevità della procedura, sia perché lunga durata d'azione anestetici non vengono utilizzati, l'uso di un dispositivo di riscaldamento animali non devono essere utilizzati per mantenere la temperatura corporea dell'animale. Una volta che l'animale è anestetizzato, gli arti posteriori e sul dorso, al livello delle creste iliache sono rasata. L'animale viene quindi posto in decubito sternale e le sue zampe posteriori sono posti in una posizione eretta approssimativa utilizzando schiuma ditta di imballaggio per sostenerlo. La cute sovrastante il cranio-più porzioni delle creste iliache, il grande trocantere del femore, della tuberosità tibiale laterale, l'articolazione del tarso, e la porzione distale e laterale del 5 ° metatarso è contrassegnato da un non-tossico pennarello indelebile. L'animale è ripreso dall'anestesia. Per gli studi temporale, anestesia periodica può essere richiesto di radere la zampe posteriori permettendo successivo collocamento marker riflettenti (vedi sotto). Inoltre, ogni giorno mettendo in evidenza dei punti di riferimento precedentemente segnato anatomici (utilizzando lo stesso marker non tossico) verrà richiesto come i ratti rimuovere lentamente il marker naturale, attraverso un comportamento governare. 5. Registrazione dei dati Tutte le viste fotocamera vengono esaminati per assicurare che la loro posizione è appropriato e catturare lo stesso campo di vista. Ogni telecamera deve essere posizionato a circa 60-80 gradi l'uno all'altro. Il campo visivo deve includere il forceplate al centro e una lunghezza di pista sufficiente a catturare due passi. Il volume di calibrazione si colloca all'interno del pre-determinata zona della pista. Un singolo fotogramma del volume di calibrazione all'interno della pista, da ciascuna delle telecamere, viene catturato. Tutti i marchi calibrato per tutta la lunghezza di ciascuno dei poli sono digitalizzati. Solo una volta un errore soddisfacente nella digitalizzazione è compiuto, lo sperimentatore può procedere alla raccolta di dati locomotore. Questa fase di calibrazione è fondamentale prima di raccolta dati. Se la calibrazione non viene eseguita correttamente, o se la calibrazione non si verifica immediatamente prima di una sessione di registrazione, tutti i dati risultanti saranno imprecisi e inutilizzabile. Importante, se una qualsiasi delle telecamere vengono toccati o spostati, è più sicuro supporre che la taratura del sistema deve essere ripetuto. Immediatamente prima di mettere l'animale in pista, il suo peso viene registrato e pre-made conica marcatori riflettenti della pelle (con nastro riflettente 3M, vedi tabella) sono rispettati i segni sentito predeterminato effettuata sulla arto posteriore punti di riferimento topografico. Registrazione del peso dell'animale permetterà normalizzazione retrospettiva di forze di reazione terra per il peso corporeo – un aspetto importante se si vuole fare confronti tra i gruppi. Inoltre, la misurazione del peso corporeo facilita il controllo della salute generale dell'animale per tutta la durata dell'esperimento. Posizionamento Marker richiede solo la gestione appropriata degli animali e non richiede l'anestesia dell'animale. Se l'adesivo sul nastro riflettente non è sufficiente per aderire alla pelle dell'animale, una piccola quantità di colla non tossica (es. tessuto adesivo 3M VetBond) può essere utilizzato per facilitare l'aderenza del marcatore sul corpo dell'animale. Una volta che i marcatori sono immessi sul arti posteriori, lo sperimentatore deve essere posizionato comodamente vicino alla tastiera del computer e hanno in mano il marcatore evento collegato attraverso il sistema Vicon Motus. Utilizzando il file calibrato come modello, diversi file sono in anticipo di registrazione. Tipicamente, 25 a 30 file devono essere salvati. Ogni file dovrebbe avere un nome univoco. Ogni file rappresenta uno registrato corsa dell'animale in fase di registrazione. Venticinque a 30 file sono tenuti a garantire che un numero sufficiente di corse incontro la velocità criterio di inclusione (cioè 60-90 cm / s) sono raccolti. Dopo un numero sufficiente di file vengono creati lo sperimentatore può iniziare la raccolta dei dati. L'indirizzo experimenter deve indurre il ratto di navetta all'interno della pista gettando pezzi ¼ di Cheerios alle due estremità della pista. Con un attento coordinamento e la tempistica, il marcatore evento viene attivato al momento di cominciare e solo prima del completamento del ratto aver completato con successo un passaggio lungo la pista. Dopo aver esaminato il greggio forza di reazione terra da lucidi, e dopo la registrazione se la sinistra o le arti di destra ha colpito la piattaforma di forza, il file viene salvato e chiuso. Ugual numero di visite arto destro e sinistro forceplate dovrebbero essere registrati. Il processo di registrazione dei dati da una data stima viene ripetuta fino a quando un numero sufficiente di corse sono stati registrati. 6. Analisi dei dati Dopo aver completato la raccolta dei dati per la cinematica e le forze di reazione di terra, ogni esecuzione di ogni animale ha bisogno di essere valutato per la velocità. Utilizzando due marcatori relativamente fissi (ad esempio ali di iliums) si può valutare un punto virtuale tra i marcatori (fatto prima quando si crea un file di Vicon Motus modello). Prima di calcolare la velocità di questo punto "virtuale", gli indicatori per i marcatori iliache devono essere digitalizzati. Utilizzando Vicon motu software, la velocità di questo punto virtuale in direzione X (direzione orizzontale del movimento) viene calcolato. In tal modo, funziona solo all'interno di una gamma di velocità di dato (determinato a priori) sono utilizzati nelle analisi finale. Troviamo che gli animali in movimento tra 60-90 cm / s sono coerenti con andature al trotto. Un minimo di 10 prove (5 corre in cui l'arto sinistro entra in contatto con la piattaforma di forza e 5 piste dove l'arto destro entra in contatto con la piattaforma di forza) sono obbligatori. Una volta che le piste accettabili sono individuati per ogni animale, la digitalizzazione dei marcatori pelle rimanenti devono essere completati. Per compensare il movimento artefatto pelle sopra il ginocchio, la stima della posizione del ginocchio è calcolata usando triangolazione (intersezione tra due cerchi cinematica 2D; o incrocio tra 2 sfere 3D cinematica), come è stato descritto in precedenza. Angoli articolari dell'anca, del ginocchio e garretto, velocità, accelerazioni e ora può essere determinato. Statica e dinamica volte può anche essere valutata, anche se la loro precisione è limitata in base alla velocità di campionamento delle telecamere essere impiegato. Questi e altri calcoli possono essere eseguiti direttamente (cioè senza export) con Vicon Motus software KineCalc, o dati possono essere esportati come dati ASCII e analizzati utilizzando le routine personalizzabile in software come MatLab. Dati a terra forza di reazione viene misurata e amplificata dalla piattaforma di forza AMTI e raccolti a 1200 Hz da Vicon Motus. Come tale, una volta che i dati reazione forza di terra vengono raccolti, un appropriato filtro digitale viene applicato ai dati utilizzando Motus Vicon. Dato che lo sperimentatore ha già stabilito la velocità del viaggio e identificato corre accettabile marcatori dopo la digitalizzazione della pelle del caso, i dati a terra forza di reazione che è stato raccolto contemporaneamente come i dati cinematici, possono essere analizzati utilizzando Vicon Motus KineCalc direttamente, o indirettamente tramite qualche altro software personalizzabile di routine. Una serie di variabili per le forze, in ciascuna delle tre direzioni ortogonali, può essere calcolato. Tali variabili includono forza massima, und zona della curva (cioè impulso), ecc importante, però, lo sperimentatore devono conservare i dati arto destro e sinistro per ogni esecuzione di ogni animale separati. Dati estratti da arti di destra o sinistra è la media per ogni animale e utilizzato come dati rappresentativi per quella animale. I dati vengono poi analizzati utilizzando procedure statistiche appropriate. 7. Rappresentante Risultati Per rappresentare l'utilità di questa forma di analisi locomotore, cinematica e le forze di reazione di terra sono stati determinati per i ratti femmine giovani, di mezza età, e geriatrica Wistar. Da questa analisi, età-correlate sono state rilevate differenze per le femmine di ratti Wistar. In particolare, la reazione analisi terreno forza dimostra che i topi anziani hanno ridotto la capacità di frenata e arti anteriori tendono ad usare le loro zampe posteriori più per la stabilizzazione laterale rispetto agli altri gruppi di animali (Figura 1). Analisi cinematica non hanno evidenziato differenze statistiche tra ciascun gruppo, dimostra però che cinematica può essere facilmente registrare da qualsiasi età di ratto (Figura 2). Figura 1 forza di reazione terra tracciamento presi dalle membra sinistra di giovani. (4 mesi, n = 7), di mezza età (13-14 mesi di età, n = 7) e geriatrico (24 mesi di età, n = 5) ratti femmine Wistar. Arti di destra erano simili. E 'evidente che i ratti geriatrica usare i loro arti anteriori meno per la frenata (* = p <0,05) rispetto ai ratti giovani e di mezza età, e ratti anziani tendono ad usare le loro zampe posteriori più per la stabilizzazione laterale rispetto ai ratti giovani (**). Linee continue rappresentano dire, le linee tratteggiate rappresentano media + SE; tratteggiatalinee rappresentano dire SE. Clicca qui per vedere una figura più grande. Figura 2. Figurine stilizzate cinematica per l'arto sinistro di ratti giovani, di mezza età, e geriatrica. Stick figure rappresentano il movimento medio del arto sinistro per ciascuno dei gruppi. Non ci sono state differenze significative tra i gruppi di animali per l'angolo comune durante il ciclo di passo. Clicca qui per vedere una figura più grande.