Injection intrapéritonéale en Zebrafish adultes

L'injection intrapéritonéale comporte cinq étapes: le jeûne, la pesée, anesthésier, l'injection et la récupération. Pour chaque étape il ya les meilleures pratiques qui peuvent assurer le succès. Le succès comprend un patient poissons en bonne santé ainsi que d'un bon résultat expérimental.

Le jeûne: un jeûne de 24 heures devrait vider l'ampoule intestinale. Cette pratique est tiré de la littérature poissons vétérinaires (par exemple, Brown, 1993). D'autres considérations de jeûne sont discutés ci-dessous.

À plus long terme à jeun: Nous avons constaté qu'un jeûne de 72 heures est nécessaire pour diminuer la glycémie à un niveau de base avant l'injection (Eames et al, 2010).. Nous avons également constaté que pour des études de glucose il ya plusieurs procédures qui sont nécessaires pour s'assurer que les poissons sont mis à jeun correctement. Commencez avec un réservoir propre (pas de débris sur le fond). Les réservoirs doivent être déconnecté, clairement étiqueté comme «jeûne», et dans un endroit où enthousiastes personnel des soins de poisson ne sera pas les nourrir. Évaluer l'environnement externe de la cuve et prendre des mesures pour empêcher les poissons d'être stressés par des perturbations, comme le stress est connu pour augmenter la glycémie (Chavin et Young, 1970;. Groff et al, 1999). Par exemple, nous avons eu une expérience dans laquelle le jeûne d'une radio a été opéré quotidiennement sur le banc qui tenait les réservoirs de poissons. Nous avons constaté que la glycémie était anormalement élevé et a conclu que les poissons ont été soulignés par les vibrations. Un autre facteur de stress est la surpopulation. Les poissons devraient être maintenus à une densité conforme aux bonnes pratiques d'élevage des poissons. Pour les recommandations, voir Brand et al. (2002) et Westerfield (1995). Nous avons eu de bons résultats à jeun nos poissons à une densité de 10-12 poissons dans un réservoir de 9 litres (avec 3 couches de billes de prendre une partie de ce volume). La séparation des sexes peut causer du stress, nous recommandons de maintenir une population mixte de sexe pendant le jeûne. Cela signifie que les œufs peuvent être établies, et les œufs ont besoin d'être séquestré, afin qu'ils ne se mange pas. Un moyen simple pour séquestrer les oeufs est de couvrir le fond du réservoir avec 2-3 couches de billes. Qualité de l'eau doit être maintenu en retirant les oeufs et les déchets et en remplaçant environ 10-15% de l'eau du réservoir, tous les jours. Pour enlever les œufs et les déchets, le siphonnage fonctionne bien.

Pesée: Lors du pesage des poissons qui ne sont pas anesthésiés, les soins devraient être prises pour minimiser le transfert de l'eau du filet dans le bécher, afin d'assurer un pesage précis. Si le net (avec du poisson) est effacé sur du papier absorbant, la majorité de l'eau en excès peut être enlevé et le poids peut être mesurée avec précision. Il peut être plus facile d'anesthésier le poisson avant la pesée, mais nous n'avons pas testé les effets possibles d'anesthésier un poisson deux fois par jour. Nous avons testé notre technique en pesant le premier poisson avec le filet / buvard méthode et puis re-pesée du poisson après qu'il a été anesthésié, et doucement effacé sec. Nous n'avons trouvé aucune différence significative de poids entre les méthodes (P = 0,7927, test t). De plus, nous avons testé si ce filet / buvard glycémie méthode affectée, en comparaison avec tout simplement le transfert des poissons dans le bécher dès qu'il est pris au filet (pas de buvard). Nous n'avons trouvé aucune différence significative dans le niveau de glucose sanguin entre les deux méthodes de transfert (P = 0,2241, test t).

Anesthésiant: anesthésie chimique peut être adapté à de nombreuses études. Ici, nous avons démontré l'anesthésie de l'eau froide comme une alternative, parce anesthésiques beaucoup (y compris tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), augmenter la glycémie. Dans des études précédentes, nous avons déterminé que l'eau froide ne pose pas de glucose dans le sang chez le poisson zèbre (Eames et al., 2010).
Pour l'anesthésie de l'eau froide, la température doit être diminué lentement. Le taux de diminution semble dépendre de la taille du poisson, avec des poissons plus petits vont plus vite que dans les plus gros poissons. Après l'injection, vous pouvez observer que le poisson se remet trop lentement de l'anesthésie (voir ci-dessous). Cela peut entraîner lorsque soit la température de départ est trop faible, ou lorsque la température diminue trop rapidement. La température de départ est trop faible si les virages poissons latéralement en entrant dans l'eau. Si la température de départ est correct, le poisson va maintenir son équilibre initialement. Il va tourner ses nageoires pectorales en position horizontale, le souffle coupé, et avoir des mouvements opercule rapide. Typiquement, il nagera. Comme la température diminue, les mouvements de va diminuer et les poissons vont perdre l'équilibre. Un avion d'une anesthésie chirurgicale est atteint lorsque le poisson peut être manipulé sans réagir. Afin de maintenir le poisson sous anesthésie chirurgicale, vos doigts doivent être à froid, afin de les garder dans l'eau avant de manipuler le poisson. L'éponge doit également être conservés au froid à la même température que l'eau utilisée pour anesthésier les poissons. Il est important de saturer l'éponge avec de l'eau qui est sufficiently froide pour maintenir l'anesthésie une fois le poisson est placé sur elle.

Injection: Avant les injections entreprise, vous voudrez peut disséquer au moins un poisson pour avoir une idée de l'épaisseur de paroi du corps. Cela peut vous aider à juger à quel point l'aiguille doit insérer pour entrer dans la cavité abdominale. De plus, comme vous insérer l'aiguille, vous pouvez sentir la paroi du corps «donner» lorsque l'aiguille pénètre dans la cavité abdominale. Pendant l'injection, prendre des mesures pour garder le patient heureux. Assurez-vous que l'éponge est saturée avec de l'eau froide température correcte pour empêcher les poissons de revivre pendant l'injection. Une éponge bien saturées et douce est importante pour minimiser les dommages à l'échelle et le mucus qui couvre de la peau. Une éponge bien saturées est également important de garder les branchies aéré. Nous recommandons fortement l'éponge en mousse énumérés ci-dessous sous Matériaux. Enfin, une fois le poisson est anesthésié, travailler rapidement pour minimiser le temps que le poisson est moins.

Recouvrement: Le poisson doit se remettre de l'anesthésie presque à l'entrée du réservoir d'eau chaude. Si le poisson ne commence pas immédiatement la natation, agiter doucement l'eau vers les branchies pour accélérer la récupération. Si la récupération est lente, puis le poisson est allé trop vite, sous et vous devriez régler la procédure d'anesthésie appropriée. Les causes possibles de la lente reprise sont examinées sous anesthésiant.