Электронного парамагнитного резонанса Микро-изображения живых видов карт для использования с кислородом

1. Обзор СОЭ Micro-изображений Во-первых, мы предлагаем краткое объяснение СОЭ, СОЭ микроскопии и различных компонентов нашей системы, и тогда мы будем описывать реальных экспериментах изображений. Электронного парамагнитного резонанса является спектроскопический метод, в котором электромагнитное излучение на определенной частоте, поглощается молекулами с неспаренных электронных спинов, помещенных под внешнего статического магнитного поля (рис. 1). СОЭ, занятых в широких областях науки, таких как химия, биология, физика и материаловедение, для обнаружения и идентификации свободных радикалов и парамагнитных центров. Это мощный метод изучения окружающей среды парамагнитных молекул в живых видов и дает информацию о кислотности (рН), вязкость, кислорода и активных форм кислорода концентрации 3. Для гетерогенных образцов, СОЭ спектральной информации можно получить с пространственным разрешением образом (например, путем получения изображения), с помощью градиентов магнитного поля 4. Это очень похоже на более распространенный метод магнитно-резонансной томографии (МРТ), которые в основном наблюдает спины протонов. До сих пор таких изображений СОЭ методы были применены для живых образцов с относительно большим размером несколько сантиметров и в мм масштаба разрешения. (Например, см. рисунок 2, взятый из работы 5.) Сравнительно недавно в ЭПР изображений является расширение ее возможностей, глядя на мелких животных в миллиметровом масштабе резолюции измерения миллиметровом и субмиллиметровом размеров образцов с микронных разрешения. Это поле известно как СОЭ микроскопии, которая сегодня может обеспечить 3D СОЭ изображения с разрешением 1 мкм приближаются 2 (см. представитель примеры в рис. 3). СОЭ микроскопом по существу аналогична обычной спектрометра ЭПР. Это магнит для генерации статического поля, микроволновые системы для возбуждения спиновых и обнаружения сигнала, зонд для проведения выборки и компьютеризированной консоли для управления процессом сбора и обработки данных. Другие компоненты уникальной СОЭ изображения в целом, а также существующие в ЭПР микроскопии обладают магнитными свойствами градиента поля источников, которые являются частью электронной системы, а также градиентных катушек, которые расположены в визуализации зонда. Более подробную информацию о нашей специфической системе показаны в протоколе кино и описан в ссылке 2. 2. СОЭ Micro-изображений пробоподготовки Эта стадия описывается метод пробоподготовки для ESR микро-изображений эксперимента. В конце этого этапа клетки располагаются в нижней части, специально подготовленные стекла СОЭ контейнере образцы микроскопии совместно с тритил радикальных 6 буферного раствора. Этот протокол описывает измерение цианобактерий клетки и, следовательно, и для других типов клеток, надлежащее корректировки могут быть необходимы на стадии подготовки образца. Во-первых, несколько квадратов впитывающей бумагой с размером ~ 400 400 мкм, принимаются и вставляются в трубку Eppendorf который впоследствии заполнены 1,2 мл цианобактерий подвеска (в концентрации 40 мг / мл). Суспензию центрифугируют в течение 2 минут при 6000 оборотов в микроцентрифужных. После этого супернатант буфер полностью удалена, за исключением ~ 50 мкл, которые остаются, чтобы избежать обезвоживания цианобактерий. В результате этого процесса, впитывающей бумагой сейчас насыщенный сине-зеленых водорослей клетки. Использование тонких пинцеты, несколько волокон выделяются из бумаги и помещают на дно чашки, как специально подготовленные держатель образца стекла 7. После этого 3 мм тритил в BG-11 решение 8, 9 (см. схему 1) добавляется к держателю образца при помощи тонкого шприца. Затем патрон запечатаны использованием УФ-клей, оставляя небольшой выход воздуха открытым. Сток 4 Складе 3 Складе 2 Месте 1 H 3 BO 3 2.86g/liter K 2 HPO 4: 3 H 2 O 4.0g/liter MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter Na 2 Mg ЭДТА 0.1g/liter MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter Железа 0.6g/liter цитрата аммония ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter Лимонная кислота: 1H2O 0.6g/liter </tг> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter CoCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter Схема 1. Подготовка BG-11 среды. 3. СОЭ Микро-изображения Эксперименты Во-первых изображений эксперимент, включите СОЭ микро-система формирования изображений и вставьте образца в резонаторе, которая идет внутри изображений зонда. Теперь, используя программное обеспечение компьютерного управления, установить систему на фирме "Мелодия" режиме и найти резонансную частоту микроволнового зонда, который будет использоваться для измерения ESR. После этого, установите статического магнитного поля на значение, которое соответствует применяются СВЧ, установить временные параметры для импульсной последовательности и наблюдать сигнал ЭПР, чтобы убедиться, что система работает хорошо, и образец хорошо подготовлены. Затем установите визуализации параметров, таких как количество пикселей, сила градиентов и длину градиента импульсы к их нужные значения. После установки, собрать три 3D-изображений, СОЭ эха Хана визуализации последовательности импульсов (рис. 4) с межимпульсный разделения, значения 500 , 600 и 700 нс. Свет прогнозируется на уровне образец включен или выключен в зависимости от требуемых условий эксперимента. Во время приобретения, данные автоматически сохраняются. Тезисы исходных файлов данные затем обрабатываются с помощью программного обеспечения Matlab сценарий предоставить изображения тритил радикальных концентрации и релаксации T 2 карты, которая переводится на изображение концентрации кислорода через уже существующие калибровки. 4. Представитель Результаты Результаты эксперимента несколько трехмерных СОЭ микро-изображения, записанные при различных значениях τ. Типичные необработанных изображений данные приведены на рисунке 5. Тройку изображений, измеренная в темное время суток, очень похожи, за исключением сокращения интенсивности сигнала. С другой стороны, изображение картины изменения под облучении светом из-за различных времен релаксации в различных частях образца. Эти данные могут быть обработаны 1, получим амплитуду изображения, как показано на Рисунке 6, а также образы время релаксации, T 2 (рис. 7). Т 2 изображения переводятся в значения концентрации кислорода через уже существующие калибровочной кривой, которая связывает концентрацию кислорода к времени релаксации с помощью уравнения: Здесь T 2 0 является спин-спиновой релаксации зонда в бескислородных условиях (в зависимости от концентрации зонда, C, и ее коэффициент диффузии, D), и к-коэффициент пропорциональности. В большинстве случаев, коэффициент диффузии не сильно отличается для живых образцов (хотя, при необходимости, она может быть в принципе непосредственно оценить также на 6 СОЭ, 10), и спина концентрации, полученные в ходе визуализации процесса. Таким образом, это отношение может быть использован для прямого измерения концентрации кислорода. Возвращаясь к рис 6, как видно из изображения, которое амплитуда цианобактерий клетки расположены в основном на правой стороне держателя образца. Кроме того, исходя рисунке 7, ясно, что свет начинает производство O 2 и приводит к значительному увеличению концентрации O 2 решения, в основном в вокселей возле цианобактерий. Рисунок 1: Энергетические уровни электронного парамагнитного резонанса. Рисунок 2: Типичный образ концентрации кислорода в опухоли мышей подшипника. Изображение слева показывает анатомические сведения, основанные на МРТ изображение. Устойчивые свободные органический радикал вводили мыши и ее СОЭ характеристики обеспечивают концентрацию кислорода в окружающей среде (справа). СОЭ основе результатов накладываются на МРТ анатомические изображения. Поле зрения составляет 32 мм. Рисунок 3: Два примера высокого разрешения микро-масштабе ESR образы photolithographically генерируемых образца с N @ C 60 порошок (слева) и LiPc парамагнитных кристаллах (справа) Рисунок 4: Типичные Хан визуализации последовательности импульсов показывает микроволновые (СВЧ) и градиент, G х, у G и G Z импульсов. Рисунок 5: Типичные необработанных данных СОЭ микро-изображений: а, б, в сырые данные цианобактерии образца без света, освещенность, измеренную при τ = 500 600 700 нс, соответственно. Элементы г, д, и такие же, как, б, в, но светом освещения. Интенсивность строится в произвольном масштабе (но последовательно в пределах каждого набора из трех темных или светлых необработанных изображений данных) Рисунок 6: Амплитуда изображение, соответствующее концентрации радикалов в растворе (произвольном масштабе). Рисунок 7: T 2 изображений и соответствующих [O 2] значения при темных (слева) и легкой (справа) условиях.