Murin Islet İzolasyon ve subkapsüler Böbrek Nakli Bir Yöntem

1. Hazırlık ve Liberase Reaktif Kalibrasyon Bu protokol Liberase TL (Roche, Kedi # 05 401 020 001) pankreas sindirim için enzim kullanır. Bir seferde 100-200mg Satınalma ve büyük bir toplu iş yapmak. Steril HPLC saflıkta su liyofilize toz konsantrasyonu başına yaklaşık 26 ml Wünsch birimleri olduğunu yeniden askıya. Bu yaklaşık 5 mg / ml olmalıdır. Prospektüste çok bulunan Wünsch birimler hakkında ayrıntılı bilgi için bkz. Her birkaç dakikada dönen Yahudi olmayan bir 30 dakika boyunca buz üzerinde şişeleri yerleştirin. Toz, 30 dakika sonunda tamamen çözülür sağlamak için kontrol edin. Havuz tüm çözünmüş birlikte Liberase ve nazik dönen (vorteks ya da sallamayın) ile karıştırın. Önceden soğutulmuş Eppendorph tüpler, sıvı azot hızlı dondurma (herhangi bir enzim gibi tedavi) ve mağaza -80 ° C kısım 24.3 Wünsch birimleri Bu Eppendorph tüp başına yaklaşık 0.935ml olmalıdır. Her kısım tek kullanımlık (11 farelere için yeterli) ve saklanan ya da, tekrar dondurulmuş bir kez çözdürülmelidir olmamalıdır. Genel olarak, hisse senedi, en az 6 ay süreyle stabildir. Her yeni parti için en uygun inkübasyon süresi kalibre edin. Mümkün olduğunca gerçek deneysel koşullar taklit etmek için, kalibrasyon, dondurulmuş stok, taze çözünmüş stok kullanın. Su tam 37 kullanmayı planladığınız banyo ° C civa termometresi kullanarak. Kalibre İlerideki denemelerde, aynı kuvöz kullanın. Kullanmadan önce, buz üzerinde Liberase bir tüp Çözülme ve son çalışma konsantrasyonu ml'de 1.08 Wünsch birimleri, 21.6ml serum serbest RPMI (0.935ml) eklemek. Serum, BAS ve EDTA Liberase inhibe ederler. Çinko ve kalsiyum kofaktör. 1.5 saat içinde buz ve kullanımı üzerinde saklayın. Bu yaklaşık 11 farelerde (2ml/mouse) için yeterli. 2.3 pankreasın perfüzyon için adım. 1 saat içinde mümkün olduğunca çok sayıda fare gibi serpmek. Sonra bir ya da iki fareler her inkübasyon süresi ve test 10, 12, 14, 16, 18 dakika inkübasyon sürelerinde kullanın. Mümkünse sindirim zamanlama çok önemli olduğu gibi, kat arasında 30 saniyelik aralıklarla içerir. Adacık izolasyon protokolü doldurun ve her inkübasyon süresi noktası adacık verim ve kalite analiz. Sonuçta verim pik saatler arasında çok fazla değişmez, ancak bu aralıklarla adacıklar kalitesi değişebilir. Daha sonraki deneyler için, koşulları izolasyon 48 saat sonra sağlıklı adacıklar en büyük sayı bu sonucu kullanın. Farelerin yaş optimum inkübasyon süresi etkileyecek gibi görünüyor. Bu nedenle, benzer bir yaş aralığı içinde farelerin kullanın. İdeal olarak, 8-12 haftalık fareler kullanmak; Ancak, hatta 8-10 aylık fareler iyi adacıklar verim alınabilir. Kalibrasyon amaçları için, genç fareler kullanın. 2. Cerrahi Prosedür Adacık donör fareler euthanizing önce tüm ekipman ve ortam hazırlayın. Otoklav alev veya aletleri kullanmadan önce sterilize edin. Tüm reaktifler ve araçlar (örnekleri dokunmadan) steril olmalıdır. Adacık izolasyonu ve elle toplama, büyük ölçüde kirlenme sıklığı artan bir laminer akış kaput dışında yapılabilir. Ancak, pankreas veya adacık ile temas araçları sterilizasyon kontaminasyonu önlemek için kritik öneme sahiptir. Aşağıdaki araçları ihtiyaç vardır: Abdominal insizyon için diseksiyon makas, 1 çift. Forseps 2 çift. Safra yolları kapalı kelepçe 1 hemostatik forseps. 0,419 mm çapında tel örgü. 0.1 mm çaplı naylon mesh. Bend birkaç 27 gauge iğne 70 derece açı iğne uzunluğu aşağı yaklaşık yarım tanıtıldı. Iğne kesik kenarı dirsek içine bakmalıdır. % 70 etanol ile bir sprey şişesine doldurun. Diseksiyon mikroskobu, bir laboratuar tezgah ya da bir başlık yeterli bir ışık kaynağı ile ayarlayın. 4 ° C'ye kadar ön-chill santrifüj Santrifüj, bir salıncak kova rotor, 900xG, yetenekli, buzdolabında ve sokulup çıkarılabiliyor bir mola gerekir. Sorvall H1000B rotor ile RT6000D bir Sorvall, 900xG hızı 2400RPM. Yavaş spin 800rpm yapılır. Buz üzerinde aşağıdaki reaktifler yerleştirin. RPMI (% 10 serumu ile 1 litre) RPMI (serum olmadan 200ml) 50ml (her biri pankreas için 1 konik tüpler) 5ml şırınga. Oda tempe Histopaque1077 dengelenmesiproblemsizce. Çözülme ve buz üzerinde kalibre Liberase tek kullanımlık kısım 22.5ml serum serbest RPMI sulandırmak. Serum, BAS ve EDTA Liberase inhibe ederler. Çinko ve kalsiyum kofaktör. 1.5 saat içinde buz ve kullanımı üzerinde saklayın. Bu yaklaşık 11 farelerde (2ml/mouse) için yeterli. Sıcak 37 ° C su banyosu. 1 saat (18 farelerin yaklaşık 10) cannulate gibi birçok fare gibi taraftan var. Kanülasyon için fare hazırlayın. Birinci servikal dislokasyon veya CO 2 boğulma fare euthanize. Fare sona eriyorsa, 2ml Liberase çalışma stok (1.08 Wünsch ünite / ml), 5ml şırınga ile doldurmak. Fare, bir kağıt diseksiyon kapsamı havlu ve karın, kasık bölgesinde bir V-kesi ile iki ön bacaklar, karın açmadan önce% 70 etanol ile sprey supin pozisyonda yerleştirin. Göğüs, karın boşluğu ortaya çıkarmak için üzerine katlayın cilt. Fare kafası size doğru bakacak şekilde yerleştirin. Şekil 1'de vurgulanan ortak safra kanalının duodenum girdisini bulun. Bu diseksiyon kapsamı amacı ile bakmadan yapılabilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi hemostatla duodenal açılış Kelepçe. Kelepçe konumu, bağırsaklara Liberase akışını engellemek için kritik öneme sahiptir. Kelepçe çok yüksek veya çok düşük ise, Liberase pankreas serpmek. Pozisyonu hemostat, böylece sıkıştırılmış, pankreas / bağırsak yatılı boyunca tam olarak çalışır. Koledok cannulating önce, karaciğer koledok tüm uzunluğu (Şek.3) maruz kalır, böylece diyafram karşı o kadar basarak yeniden konumlandırmak için gerekli olabilir. Bir kez safra yollarının uzunluğu maruz kanülasyon şırınga Liberase bağlı bükük 27-gague iğne kullanın. Safra kanalı cannulating için iki teknik vardır. İlk teknik, ya da 'serbest el' yöntemi, hemostat duodenum, koledok gergin olacak şekilde, kuyruk doğru fare kafası uzak çekilir üzerinde kenetli. Karaciğer, safra bağırsaklarda girmeden önce bir araya gelip, safra kesesi ve karaciğer enzimleri drenaj safra kanalı yakın bir izdiham vardır. Bu izdiham oluşturduğu V içi safra kanalı sıkı çekerek maruz kalan ve kanal (Şekil 4) kanülasyon başlatmak için ideal bir yerdir. Eğer doğru yerleştirilmiş, iğne V ile doğru kaydırın ve doğrudan kanalının alt kısmında cannulate. Iğne birkaç milimetre Liberase dağıtım önce kanal içine yerleştirin. Optimal iğne yerleştirilmesi, karaciğer ve safra kesesi içine akışı önlemek için önemlidir. Buna ek olarak, şimdiye kadar dalak kanalı tıkar iğne eklenebilir değil önemlidir. Dalak kanalı koledok şube görmek için zordur ve dalak, pankreas adacık zengin bir alan kuyruk Kanalizasyona. Iğne dalak kanalı için açılış geçmiş slaytlar, dalak kuyruğu tam perfüzyon ve bu alanda potansiyel azalır sindirim daha az olacaktır. Optimal adacık verim iğne derinliği yeteri kadar hiçbir Liberase şimdiye kadar karaciğer / safra kesesi, dalak kanalı ilettik kaçar ama o zaman oluşur. Liberase küçük bir miktar dağıtım başarılı kanülasyon için test edebilirsiniz. Kanal dolgu Liberase görürseniz 2mls geri kalanı dağıtmak. Kanalı etrafındaki alanı doldurmak başlarsa, dağıtımı durdurmak iğne yeniden konumlandırmak ve tekrar deneyin. İkinci teknik, ya da 'forseps yardımcı' yöntemi, hemostat koledok gergin olacak şekilde, kuyruk doğru fare kafası uzak çekilir duodenum kelepçeli. Sonra eğilmiş 27-gague iğne yakın karaciğer safra kanalı altında fasya ponksiyon, 5ml şırınga bağlı. Iğne kanalı (Şekil 5) fasya temizlemek için kullanın. Hala yerinde iğne ile hemostat belirlenen ve forseps bir çift pick up. Iğne fasya temizlenir safra kanalı yukarı kaldırmak için bir kol açık forseps kullanın. Forseps sırtlar kanal içine iğne rehberlik etmek için kullanabileceğiniz bir sistem oluşturun. , Kendinize doğru kanalı ve forseps çekerken, bir duraktır forseps kullanarak kanal içine iğne kaydırın. Liberase küçük bir miktar dağıtım kanülasyon için sınayın. Kanalı doldurmak için (fig.5 Ok) başlarsa, 2mls geri kalanı dağıtmak. Kanalı etrafındaki alanı doldurmak başlarsa, dağıtımı durdurmak iğne yeniden konumlandırmak ve tekrar deneyin. Liberase 2mls pankreas, onikiparmak bağırsağı mide üstüne bölge ve nihayet dalak kuyruğu (Şekil 6), ilk genişletmeye başlar yakın bölge doldurur. Pankreasın bile genişleme (Şekil 6 arayın.) Bir alanda genişlemeye başlar ve eşit beyaz doku genişletilmesi ve yayılan görmüyorum, koledok kanüle olmamıştır muhtemeldir, ama iğne pankreas kapsülü içinde. Liberase ile kapsül dolum enzim maruz kalan yüzey alanı düşük olacak gibi yüksek bir adacık verimi neden olmayacak. Bu durum ortaya çıkarsa, perfüzyon durdurmak ve iğne yeniden konumlandırmak. Pankreas perfüze edildikten sonra, bağırsak, mide ve dalak ile temas noktalarından ücretsiz çekerek fare kaldırılır. Onikiparmak bağırsağı hemostat kaldırarak başlayın. Sonra, duodenum asansör ve forseps ikinci bir çift (Şekil 7a-B) ile bağırsak, pankreas ayırmak için forseps kullanabilir. Bu karın bağırsakların dışarı çekerken forseps ikinci çifti sabit tutarak yapılır. Sonra, midenin üst ve (FIG.7C D) dalak, pankreas çekin. Son olarak, karın pankreas dışarı çıkarın ve kalan fasya bağlantıları (FIG.7E F) ücretsiz kesmek. Diğer fareler üzerinde çalışırken 50ml konik bir tüp içinde pankreas koyun ve buz üzerinde bırakın. 1 saat Sayacı başlat. Maksimal adacık verim için her bir tüp içinde, sadece 1 pankreas yerleştirin. Liberase doku düşmeye başlayacak, 1 saatten fazla buz üzerinde perfüze pancreata bırakmak tavsiye edilmez. Saat sonunda, derhal perfüze edildi pancreata 3.0 adıma geçin. Adımları tekrarlayın 2.3 – 2.6 kalan fareler ya da 1 saat zamanlayıcı Adım 2.6 başlayıncaya kadar süresi doldu. 3. Perfüze Pancreata Arındırıcı Islets Pankreas adacık arınmış önce, doku 37 sindirilir olmalıdır ° C Grup, 37 ° C su banyosunda sığar açık bir alt rafa perfüze adacıklar taşıyan 50ml tüpler. Tüm kapaklar (adım 1.4 'e bakınız) Liberase mevcut toplu iş için önceden belirlenmiş güvenli ve kesin miktar zaman için 37 ° C su banyosuna daldırın tüpler olduğunu emin olun. Inkübasyon sonunda, buz tüpleri taşımak ve% 10 tüp başına 20mls serum ile RPMI1640 ekleyin. Serum içeren medya Liberase sindirimi durdurur. 40 kez 10 saniye kuvvetlice tüpler sallayarak doku ayırabileceği. Bu adım, adacıklar optimal kurtarma için kritik öneme sahiptir. Doku kırık değilse bile, en iyi Liberase perfüzyon ve sıkı bir şekilde kalibre sindirim süresi, adacık verim düşük olacaktır. Bu adımda örnekleri agresif kullanımı, fare adacıklar zarar görünür ve ekzokrin hücre kümeleri onları serbest bırakmak için gerekli değildir. Sindirilmiş pankreas adacık ayırmak için, aşağıdaki adımları tamamlayın. Tüp başına yaklaşık 2.5 pancreata vardır, böylece Havuzu pancreata sindirilir. Bunu yaparken, on tüpler medya her 50mls 4 tüplerine yoğunlaşmış olacaktır. 800rpm ve 4 az 2 dakika boyunca Santrifüj tüpleri ° C Süpernatantı dökün ve birkaç saniye hafifçe karıştırın (maksimum yaklaşık% 50 vorteks yoğunluğunu ayarlamak)% 10 FBS ile 15-25mls medya pelet tekrar süspansiyon haline getirin. 0.419mm tel örgü ile yeniden süspanse şerbeti dökün ve taze bir 50ml konik tüp içine huni. Bu non-sindirilmiş dokusu, yağ ve lenf ayırır. % 10 FBS ve tel örgü ile dökün içeren ek bir 10mls medya ile ilk tüp durulayın. Kalan tüpler için bu işlemi tekrarlayın. 800rpm ve 4 az 2 dakika boyunca tüpleri Santrifüj ° C Süpernatantı dökün ve bir kağıt havlu üzerinde dikkatlice tüpler ters. Adacıklar kapalı slayt olmadığını emin olmak için izleyin. Hücre pelletini rahatsız etmemek için dikkatli olmak, tüplerin içinde kalan ortamı çıkarmak için bir kağıt havlu ile silin. Tüpler dik bir pozisyona dönün. Oda sıcaklığında histopaque1077 5mls pelet yeniden süspanse birkaç saniye hafifçe karıştırın. Süspansiyon tüpün iç etrafında histopaque bir ek 5mls eklemeden önce homojen olduğundan emin olun. Bu tüpün duvarı kapalı adacıklar yıkar. Yerleşimi histopaque, serum serbest RPMI 10mls histopaque ve medya arasındaki keskin bir arayüz korumak için dikkatli olmak. 10 saniyede 1 ml bir oranda tüp tarafında yavaşça pipetleme medya ekleyin. Ortamı, üst ve alt histopaque gerekir. Serum medya yoğunluğunu etkiler ve bu adımı sırasında kullanılan olmamalıdır. Dengelenmiş bir Santrifüj örnekleri Spin 20 ° C'de 20 dakika ve çok yavaş bir ivme ile frenleme için 2400RPM (900xG). Bu adım, ekzokrin hücreleri adacıkları birbirinden ayırır. Adacıklar, serum serbest medya ve Histopaque arasındaki arayüz göç ederken ekzokrin hücreler witüpün dibinde bir granüle ll. Tek 10ml Serolojik pipet ile medya / histopaque arayüzü adacıklar toplayın. Adacıklar cam sopa, bu nedenle silikonlu yoksa cam pipetler kullanılmamalıdır. Adacıklar taze 50ml konik tüp içine yerleştirin. Çeşitli tüpler bu noktada toplanmış olabilir. 50ml için tüpler içeren serum RPMI ile doldurun. 800rpm ve 4 az 2 dakika boyunca Santrifüj tüpleri ° C Süpernatantı dökün ve hafifçe karıştırın içeren serum RPMI 50mls adacıklar tekrar süspansiyon haline getirin. 90 saniye boyunca tüpler Santrifüj 800rpm ve 4 ° C Süpernatantı dökün ve 1 daha fazla zaman yıkayın tekrar. Süpernatantı dökün ve doku kültürü kaputu tüpleri almak. Adacık kültür ortamı yapmak için final konsantrasyon% 1% 10 FBS içeren RPMI pen / strep ekleyin. Bu kültür ortamı 5mls adacıklar süspanse edin. 0.1mm bir naylon hücre süzgeci ters çevirin ve konik tüp 15ml üzerine yerleştirin. Süzgeç ile yeniden süspanse adacık bulamaç yavaş yavaş geçer. Ekzokrin hücreleri konik tüp 15ml içine geçmesine adacıklar süzgeç tarafından muhafaza edilecektir. Bu adım önemli ölçüde protokol sonunda ekzokrin hücre kontaminasyon açısından adacıklar saflığını artırır. 50ml konik tüp ek bir ortam 6mls ile yıkayın ve süzgeç aracılığıyla pipetle. 10 cm'lik petri büyük bir damla olarak kültür ortamı Yeri 3mls. Adacıklar yakalamak için kullanılan yüzey medya damla daldırılır, böylece hücre süzgecinden sağ tarafta ters çevirin. Medya filtre dokunulması petri tedavi olmayan bir doku kültürü içine adacıklar en iyi transfer olacak. Olmayan bir tedavi petri kullanarak, plaka yüzeyine adacık yapışma ve yayılma önlemek için kritik öneme sahiptir. Ücretsiz yüzen adacıklar deneysel gruba ayrılması için çok daha kolay toplanır. Süzgeç çanak içine herhangi bir kalıntı adacıklar yıkayın petri kültür ortamı içine süzgeç yoluyla ek bir 5-7mls Pipet. 4x amacı ters bir mikroskop altında adacık verim ve kalitesini kontrol edin. Sıkı bir oval çanak dönen yemeğin ortasında adacıklar toplayacaktır. Adacıklar iyi bakarsanız, onlar da deneysel kullanım için hemen toplanır ya da 4-6 10cm petri tabak (10 farelere göre) arasında eşit olarak ayrılır. Aynı çanak kültür çok sayıda adacık, adacıklar nekrotik ve aşağılamak haline getirir. Deneyler için, 2-medya 3mls ile 6cm çanak başına 250-300 adacıklar adacıklar stres görünmüyor. Ile 0.1mm naylon hücre süzgecinden akışı toplanan konik tüp 15ml kullanılabilir bazı adacıklar olacaktır. Bu adacıklar yerçekimi sedimantasyon 3-4 tur sonra telafi edilebilir. Sedimantasyon yaklaşık 4 dakika sonra aspire ama kültür medya ile üst tüp ve dolum bu medya yaklaşık 1 ml. Tüp kap ve karıştırmak için ters. Bu işlemi birkaç kez tekrar tortu yavaş olan tek hücre ekzokrin hücreler birçok kaldırır ve hızla batmaya endokrin hücreler (adacıklar) ağır agrega zenginleştirir. Son aspirasyon sonra, kültür ortamı ve taze bir petri levha 7mls tekrar süspansiyon haline getirin. 4. İzole Islets Çalışma Izolasyon süreci adacıklar üzerinde oldukça stresli olabilir; histopaque sallayarak, toksik ve santrifüj adımları sırf stres neden, ana kan temini de çıkarılmasını ve in vitro kültür gibi hipoksi uyarabilir. Biz ve diğerleri izolasyon beta-hücre ölümü 4-5 uyardığı gösterilmiştir. Bu gerilimlerin etkisini çevreden adacık hücrelerinin dökülmesi ve adacık merkezi çekirdek (merkezi nekroz) koyulaşması ve sınırdışı tarafından görülür. Çevreden hücrelerinin dökülmesi tolere edilebilir olsa da, adacık merkezi nekroz deneylerde kullanılmak için yetkisini elinden alır. Tipik olarak, daha büyük bir adacık, merkezi nekroz bir sorun olacağını şansı daha fazla. Adacık sonrası yalıtım stres yanıtı azaltmayı amaçlayan çabalar kullanılabilir adacıklar verim artacaktır. Bu nedenle, biz önceden bildirilen bir izolasyon 6-8 sonraki ilk 48-72 saat 22-27 ° C doku kültürü inkübatör adacıklar kuluçka tekniği kullanır . Bu indirgenmiş sıcaklık adacıklar stres yanıtı azaltan ve in vitro kültür onların geçiş düzgünleştirir. 22-27 ° C doku kültürü kuvöz mevcut değilse, ısı kontrol kapatarak ve yaklaşık 20 £ yerleştirerek standart doku kültürü inkübatör istenen sıcaklık aralığı elde etmek mümkündür-80 dengelenmiş dondurucu tuğla ° C Bu sonuç inkübatör düşük sıcaklık yaklaşık 16-24hours. Gerektiği gibi -80 ° C derin dondurucu tuğla değiştirin. Biz, 72 saat daha uzun bu düşük sıcaklıkta inkübasyon ek bir yararı görülmez. Düşük sıcaklık kuluçka ek olarak, izolasyon sonra medya 24-48 saat değiştirmenizi öneririz. Stresli ve ölü adacıklar salgılanan faktörler medya aşağıdaki izolasyon birikir ve ek bir adacık stres teşvik edebilir. Ortamı değiştirmek için aşağıdaki adımları tamamlayın. Plastik bir pipet kullanarak 15ml konik bir tüp, petri, medya ve adacıklar aktarın. Kalan adacıklar toplamak için ek bir kültür ortamı 3mls plaka yıkayın. Bu ek 3mls konik tüp 15ml ekleyin ve 5 dk için yerçekimi tortu adacıklar izin. Konik tüp 15ml tüm medya 1ml aspire sonra adacık kültür medya 4mls adacıklar tekrar süspansiyon haline getirin. Taze bir petri tabak, adacıklar ve medya aktarın. Herhangi bir kalıntı adacıklar toplamak ve petri tabak eklemek için ek bir kültür ortamı 3mls 15ml konik tüp ekleyin. Her üç ila beş gün sonrasında adacık medya değiştirin. Bir deney için adacıklar seçerken, farklı izolasyonların adacıklar karışımı tavsiye edilmez. Adacıklar moleküler temel kültür zaman miktarı ve hazırlık gelen hazırlık değişir izolasyon stres de dahil olmak üzere, pek çok şeyler etkilenir. Değişkenliği azaltmak için, aynı zamanda izole edildi adacıklar, adacık deneyler yapılmalıdır. Ancak bu mümkün değilse, şiddetle deneyler için onları seçmek için önce tek bir grup halinde tüm adacıklar havuzu öneririz. Deneyler için adacıklar almak için, aşağıdaki adımları tamamlayın. Adacıklar arasındaki adımları yukarıda listelenen 4.3.5 4.3.1 takip ederek tek bir çanak içine birden fazla çanak, havuz, bütün adacıkları kuluçka. Adacıklar birden fazla yemekler yer alıyorsa, 50ml konik tüp, 15ml tüp yerine kullanılan olmalıdır. Bu izolasyon sonrası iyileşme döneminde, plakalar arasındaki kültür koşulları ince farkları tarafından uyarılan değişkenlik azaltabilir. Adacıklar ağırlık tortu sırasında, 4x veya 10x objektif ile donatılmış bir inverted mikroskop kurdu. , P200 mikropipet ve P200 ipuçları steril bir kutu toplayın. Tek bir plaka tortulaşmış adacıklar transferi ve mikroskop plaka taşımak. Swirl plaka merkezi haline adacıklar toplamak için. Plaka kapağını çıkarın ve sağlıklı adacıklar almak için P200 pipet kullanın. Sağlıklı adacıklar, düz yatılı ve koyu merkezi bölgeleri (Şekil 8). Adacık boyutu tedaviye yanıt değiştirebilir adacık boyutları deneysel yemekler boyunca eşit dağılımını sağlamak için çalışın. Deney grubu başına adacık dizi deney ihtiyaçlarına göre değişir. Biz bir adacık yaklaşık 1000-2000 hücreleri ve protein ve toplam RNA 25ng 0.3-1μg verecektir tahmin ediyoruz. In vitro tayinlerde, 35mm veya 6cm yemekleri tipik bir deney grubu medya 1-3ml ile 100 arasında ve 250 adacıktan kaplı olabilir. Transplantasyonu için, her alıcı fare, deney tasarımı (Daha fazla ayrıntı için adım 5.2.2 ve Tartışma bakın) bağlı olarak 150 ve 400 arasında adacıklar gerektirir. Elle toplama işlemi tarafından tanıtılan varyasyonların en aza indirmek için, biz orifis adacık boyutunu tahmin etmek için bir kılavuz olarak P200-pipet kullanın. Çoğu adacıklar delik çapı yaklaşık yarısı bir çapa sahip ve her biri bir standart adacık olarak sayılır. Herhangi bir adacık daha büyük veya daha küçük, buna göre farklı bir adacık sayısı atayabilirsiniz. Biz 20-50 toplu adacıklar toplamak ve belirlenen deneysel yemekler aktarabilirsiniz. P200-pipet 180 mikrolitre hacmi ise birden çok adacıklar (genellikle 50 adacıklar fazla), tek bir ipucu toplamak. Böylece, adacıklar, bir defada bir toplanır olsa bile, bir Pipetman serbest bırakma mekanizması kontrol ederek her P200 ucu içinde çok sayıda küçük adacık toplayabilirsiniz. Bu yüzlerce toplama ya da daha deneyler için gerekli adacıklar bin daha kolaylaştırır. Ayrıca, benzer kalite ve büyüklüğü ile adacıklar dağıtım dışarı bile yardımcı olmak için bu toplu bilge operasyon kullanın. 5. Subkapsüler Böbrek Adacık Transplantasyonu Transplant farelerde diyabeti neden. 4 ila 6 saatlik hızlı yerleştirin fareler. Optimal transplant alıcıları, 6 ila 10 arasında hafta eski ve hızlı zamanda 20 ila 25 gram ağırlığında olmalıdır. Hızlı fareler için feedi gıda kaldırmakng raf ve her zaman taze bir kafes fareler. Bu fareler, daha önce, kafes içine düşmüş olabilir gıda herhangi bir kalıntı bitten ayırarak gerçek bir hızlı sağlar. Farelerin% 80 -% 90 diyabetik olmak için planlayın. Hızlı içine üç saat, Sodyum Sitrat Tamponu hazırlar. Enzim sınıf Sodyum Sitrat 0.735g tartılır (Na Sitrat, Bay 294,10 g / mol) ve steril deiyonize su 25mls çözülür. PH 4.5 HCl kullanarak ayarlayın. Bu tampon deneyleri her tur için taze olarak yapılmalıdır. 1.5ml Eppendorph tüp içine yerleştirin 0.05g Streptozotosinde (STZ, M r 265,2 g / mol). Bu miktar yaklaşık 8 fareler diyabet ikna etmek için yeterli olacaktır. Enjekte edilecek farelerin sayısı için yeterli sayıda 1.5ml tüpleri hazırlayın. STZ ışığa karşı hassastır, bu yüzden, alüminyum folyo ile her tüp kaplayın. Hızlı, 4 saat sonra, 1 ml taze Tampon Sitrat Na STZ bir tüp tekrar süspansiyon haline getirin. Bir kez yeniden süspanse, STZ-Na Sitrat çözüm 15 ila 20 dakika içinde faaliyet kaybeder, bu yüzden bu adımı sadece farelere enjekte hemen önce yapılmalıdır. Fare 190mg/kg son bir doz elde etmek için uygun bir STZ-Na Sitrat çözüm hacmi ile her fare intraperitoneal olarak enjekte edilir. Bu doz zorlanma ve fare yaşına göre değişebilir, bu nedenle çok sayıda fareler aşağıdaki enjeksiyon 3 ila 5 gün içinde ölüyor, diyabet insidansı çok düşük veya eğer bir doz ayarlaması yapmak gerekebilir. Ortak dozlarda 250mg/kg fare fare 150mg/kg aralığı kullandı. Tüm farelere enjekte edilmiştir kez yiyecek ve su kaynağı. Tokluk hiperglisemi Test fareler 2 ila 4 gün sonra enjeksiyon (350mg/kg). Tokluk hiperglisemi 3 gün üst üste göstermek Fare transplant alıcıları olarak kullanılıyor olabilir. Transplantasyon için adacıklar hazırlayın 2.0 – 4.0 üzerinden adımları yukarıda açıklandığı gibi adacıkları izole edin. Gerekirse, adacık nakli veya bir gün önce izole edilebilir. 1.5ml steril Eppendorph tüpler içine koyarak nakli için gruba adacıklar seçin. Tüpler buz üzerinde tutun. Normoglycemia geri yüklemek için gerekli adacıklar dizi deney (adacık donör zorlanma, ağırlık ve gerginlik alıcı ve alıcıya verilen herhangi bir ek tedaviler) ve adacıklar toplama kişi koşullar göz önüne alındığında değişebilir. Alıcı fare boyutu önemli bir değişken, daha büyük fareler daha adacıklar ihtiyaç olarak, minimal adacık sayısını etkiler. Biz sürekli, C57BL / 6 alıcı fare 20gram, 18, 300 adacıklar veya daha fazla iyileştirici ise 150 ila 250 adacık sadece marjinal normoglycemia geri bulabilirsiniz. Bu deneylerde, adacık donör fareler C57BL / 6 veya Balb / c Subkapsüler böbrek kese Nakli adacıklar Aşağıdaki malzemeleri (tüm cerrahi aletlerin sterilize edilmelidir) birleştirin: Tablo 1. Nakli için donatım 25μl Hamilton Şırınga Bu yüzden bir tarafa eğimli PE 50 esnek borular 6 "cut Jel yükleme ve P200 pipet uçları Steril Eppendorph tüpleri (alıcı başına 1) Izofluran ve İsofluranın buharlaştırıcı Eppendorph tüp raf McPherson Vannas Makas (1) Bent kol forseps (2) Hemostat (1) Yara klibi klipleri 27 iğne Alev * cam kapiller tüp probları çekti Pamuk aplikatörler uçlu 50ml konik tüp steril PBS Dikişler Elektrik Makaslar % 70 Etanol Sprey şişe Tükenmez kalem Betadine şeffaf plastik steril örtüyü * Not: bu problar hazırlanırken, fare böbrek açısı taklit prob bir yay oluşturmak için çalışır. Buna ek olarak, probun yeterince keskin kenarlar var olduğunu cilalı Alevli olduğunu emin olun. Tüm diyabetik alıcı fareler etiketi ve tartılır. Her grup benzer bir vücut ağırlığına uyumlu olacak şekilde nakli için önce deneysel bir grup farenin her atayın. İsofluranın buharlaştırıcı gaz çıkışı ile donatılmış bir açık ön kaput içinde bir cerrahi alanında ayarlayın. Sahip bir alıcı fare kanadını elektrikli makas ile tıraş sonra izofluran anestezisi. Tıraş nakli yapılacaktır alanının dışında fare. Anestezi ve pozisyon traş kanadında yukarı bakacak şekilde ve doğrudan bir cam çubuk milin üzerine dikey uzanan fare dönün. % 70 Etanol Sprey kanadını. Fare betadin ve alkol üç kez tekrarlanır alternatif bir cerrahi fırçalayın ile prepped olmaktır. Traş kanadını erişim sağlayan açık steril örtüyü fare Örtüsü. Fare anestezi edilirken adacık nakli için hazırlayın. Aşağıdaki adımları tamamlayarak bunu yapın. 1.5ml Eppendorph tüpün ağzına ucu dar sonunda bir U şekli yapan nazik bir viraj olacak şekilde steril bir jel yükleme ucu yerleştirin. Ucunun açılması Eppendorph tüp doğrudan yukarı bakacak şekilde olmalıdır. Bu adacıklar ve nakledilen adacıklar sayısında bir azalma makaslama sonucu olarak jel yükleme ucu herhangi bir noktada bir bükülme tanıtmak etmeyin. Adım 5.2.2 hazırlanmıştır adacıklar bir buz tüpü yavaşça çıkarın. Adacıklar tüpün alt kısmında yerleşmiş olmalıdır. P200 pipet kullanarak, yavaşça tüpün dibinden en az bir hacim içinde adacıklar toplamak. Adım 5.3.6.1 hazırlanan jel yükleme ucu büyük bir açıklıktan bu adacıklar aktarın. Adacıklar, jel yükleme ucu dar uzunluğu ya da dar bir kısıtlama yerleşmek gerekir. Adacıklar tortulaşmış sonra, jel yükleme ucu mümkün olduğu kadar medya kaldırmak. Bu medya adacık taşıyan jel yükleme ucu büyük bir açıklıktan aspire P200 pipet bağlı yeni bir jel yükleme ucunu kullanarak yapılabilir. PE 50 esnek borular (~ 15cm uzunluğunda) tortulaşmış adacıklar içine aktarın. Bu P200 pipet ucu takmadan önce adacık taşıyan jel yükleme ucu dar açılması için ilk tüp olmayan Eğimli sonuna ekleyerek yapılabilir. Adacıklar sonra boru uzunluğu% 60 ile itilebilir. 25μl Hamilton şırınga adacık taşıyan PE 50 boru aktarın. Şırınga pistonu tüp aktarmadan önce çekilmiş olduğundan emin olun. Şırınga, iğne, 50 PE boru olmayan eğimli kenar bağlayın. Adacıklar kesik açılması yaklaşık 0.5cm kadar şırınga pistonu basınız. Böbrek adacıklar almak için hazırlanan edilirken adacıklar kesik tüp açılışına yakın tek bir kütle haline razı olabilir kenara şırınga ayarlayın. Parmaklarınızı kullanarak, fare anestezi altında deri yoluyla böbrek yerelleştirmek. Tükenmez kalem şaft doğrudan böbrek bulunur ve omurilik dik konumlandırılmış alanı altında olmalıdır. Böbrek lokalize sonra omurilik bir dik yönde doğrudan yukarıda dermis ile 2cm bir kesi yapmak için McPherson Vannas makas kullanın. Bu kesi periton duvar gösterecektir. McPherson Vannas makas periton dermal tabaka ile kesilmiş olarak aynı yönde duvarın üzerinden 1cm bir kesi yapmak. Bu kesi tarafından oluşturulan açılış maruz kalma böbrek daha küçük olması önemlidir. Inci aşağı basarak bir duraktır olarak cam çubuk mil kullanarak, peritoneal açıklıktan böbrek zorlamake komşu yüzey. Açılış böbrek biraz daha küçük ise, böbrek, ek herhangi bir manipülasyon ya da temas etmeden farenin yüzey üzerinde stabil bir şekilde açılması ve dinlenme ile sıkmak. Bu konumlandırma, daha sonraki nakli adımlar için en uygunudur. Açılması çok büyük ise, zor sonraki adımları tamamlamak için böbrek, periton boşluğuna geri düşecek. Buz soğuk steril PBS ile ıslatılmış bir pamuk kullanarak maruz böbrek yüzeyi ıslak uçlu bir aplikatör. Bu adım, her birkaç dakikada bir tekrarlayın ya da böbrek kapsülü kurumasını önlemek için gereklidir. 27 gauge iğne kullanılarak, sol yan tarafında sağ yan tarafına doğru hareket böbrek ön yüzeyi boyunca böbrek kapsülü ile 0.2cm bir kesi yapmak. Alev kullanılması, böbrek kapsül ve böbrek parankimi arasında bir kese oluşturmak, cam kapiller tüp prob çekti. Adım 5.3.12 yapılan kesi yoluyla prob ekleyerek bunu ve böbrek dorsal lateral yüzeyi boyunca posterior yönde hareket ettirin. Ideal bir prob böbrek Bu yüzeyin doğal ark eşleşen bir viraj var. Bu prob büyük bir ön açılış açık yırtmadan böbrek en arka sonuna ulaşmak için izin verecektir. Mümkün olduğunca uzun ve dar olarak bu kese yapmak önemlidir. Adacıklar kapsül kaçmasına izin olarak kısa, geniş torbalar ideal değildir. Uzun ve dar torbalar adacıklar kapsüler kese kaybıyla böbrek arka sonuna doğru yatırılır izin verir. Adım 5.3.6 hazırlanan 25μl Hamilton şırınga Al ve adacıklar, esnek tüp kesik açılması çok kenarına taşıyın. Esnek borular eğimli kenar adım 5.3.13 hazırlanan subkapsüler poşet içine yerleştirin. Eğimli kenarı uzun kenarı böbrek parankimi ile temas, böylece yukarı bakacak şekilde olmalıdır. Tüp, kapsül en arka sonuna kadar hareket ettirin. Yavaş yavaş şırınga Medyumu subkapsüler kese içine PE 50 tüpten adacıklar transfer. Adacıklar yatırılır adacıklar için daha fazla dışarı yavaş yavaş geri esnek bir tüp kese doldurmak. Tüm adacıklar kese içine tüp aktarılır emin olun. Kese hava veya aşırı sıvı ile doldurmayın. PE 50 tüp poşeti çıkardıktan sonra, alev kese proksimal ucunu hafifçe adacıklar paketi çekti cam kapiller tüp prob kullanın. Posterior anterior yönde hareket böbrek dış yüzeyi boyunca cam probu kaydırarak bunu yapın. Çok sıkı olabilir rüptüre subkapsüler kese arka uç olarak adacıklar paketi ve adacıklar serbest bırakmak için dikkatli kullanın. Bu adım, böbrek, periton boşluğunun içine yerleştirilen kese ön açılış adacıklar kaybını en aza indirir. Bükülmüş bir kolu forseps böbrek için yapılan açılış komşu periton astar kaldırın ve daha sonra PBS batırılmış pamuk kullanın böbrek periton boşluğuna yavaşça geri itmek için aplikatör uçlu. Dermal tabakasına periton duvar ve yara klipleri sütür uygulayarak fare kapatın. 5.3.19 kalan fareler için kafes ve adımları tekrarlayın 5.3.4 fare dönün. Fare anesteziden tamamen iyileşene kadar Fare kafesi altında bir ısıtma yastığı veya korunan gözleri ile bir ısıtma lambası ile sıcak tutulmalıdır. Hayvanlar su (6 mg / ml) acetominophine ile sağlanmalıdır. Tokluk kan şekeri düzeyleri 24 saat sonra kontrol edin. Tüm fareler operasyon sonrası gün (POD) 1 (kan şekeri <200mg/dl) normoglycemic olmalıdır. 6. Temsilcisi Sonuçlar İki ana esaslar bu protokol tanımlanmıştır: (1) adacık izolasyon ve (2) böbrek kapsülü altında adacık nakli. Adacık izolasyon prosedürü, adacık verimi genellikle fare yaş ve gerginlik bağlı olarak ortalama 100-150 adacıklar arasında değişmektedir. Ekzokrin pankreas hücreleri ayırma açısından bu adacıklar saflık her hazırlık arasında yaygın olarak değişebilir. Ancak oda sıcaklığında Histopaque1077 adım 3.3.7 ve 3.3.17 adım bir 0.1mm naylon filtre kullanımı genellikle% 99 daha fazla saflık adacık izin. Bu saflık adacıklar herhangi bir ek el almadan önce elde edilir. Adacıklar aşağıdaki izolasyon Temsilcisi görüntüleri Şekil 8D gösterilmiştir. Bu görüntüleri de görüldüğü gibi, adacıklar genellikle hemen ardından izolasyon kaba bir periferik sınır var. Ancak, kültür zaman sağlıklı adacıklar kazanmak ve pürüzsüz bir sınır (Şekil 8D) muhafaza edecektir. Bazı adacıklar, merkezi bir nekrotik bölgede geliştirmek,çekirdek karanlık bir alan olarak görünen. Bu nekrotik merkezi çoğu zaman atlamalı görüntüleme (Ek Video 1) tarafından yakalanan adacık atılır. Kalan adacıklar merkezinde içi boş (veriler gösterilmemiştir) ve muhtemelen işlevsel değildir görünür. Bu nedenle, biz, elle toplama işlemi sırasında karanlık merkezi ile adacıklar dahil değildir. Daha da önemlisi, düşük sıcaklık izolasyon prosedürü izleyerek bir inkübasyon (Adım 4.2), kültür merkezi nekroz zamanla gelişecektir adacıklar sayısı önemli ölçüde azaltabilir bulundu. Adacık nakli prosedürü, iki adım önemlidir: diyabet ve böbrek alt kapsül alan adacıklar teslim kimyasal indüksiyon. Diyabet indüksiyonu için hedef STZ-enjekte edilen farelerin% 90 daha hiperglisemik elde etmektir. Bu fareler, birkaç hafta nakli olmadan hayatta. Bu hedefe ulaşmak için optimal doz STZ fare suşlarının ve yaşa bağlı olarak değişir, ve deneysel olarak tespit edilmelidir. 20mg/kg vücut ağırlığı gibi küçük bir fark, büyük bir fark yaratabilir bulundu. Böylece, bir titrasyon dar aralıklarla yapılmalıdır. Adacık nakli için kilit önem dört immünolojik bağlamlarda modelleri, allojenik singeneik, otoimmün ve otoimmün allojenik singenik:. Singeneik modeli, donör gerginlik alıcı suşu olarak aynıdır. Böylece, adacıklar alıcılardan adaptif immün yanıt çağırmak olmaz. Bu araştırmacılar çevre sorunlarını araştırmak için "primer non-fonksiyon sağlar", disfonksiyon ve alıcılar tarafından spesifik immün rejeksiyon dışındaki nedenlerden dolayı kayıp Adacık başvurarak bir terim. İlköğretim non-fonksiyon erken ekimi aşamasında ve euglycemia ulaşmak için çok sayıda adacık (≥ 2 pancreata / hasta) ihtiyaç için adacık başarısızlığın ana nedeni olarak düşünülmektedir. Böylece, adacık nakli için kritik bir konu. Bu model, marjinal bir adacık kitle tamamen normoglycemia kullanılmalı ve fareler genellikle POD 1 arasında POD 7 transplantasyonundan sonra erken bir aşamada kan şekeri için muayene edilmelidir geri gelmez. Deneyimlerimize göre, adacıklar marjinal bir kitle genellikle 150 ile farelerin C57BL / 6 suşu kullanarak 20 gram alıcı başına 250 ortalama büyüklükteki adacıklar. Singeneik modeli ile biri, belirli bir modülasyon transplantasyonu sonrası erken bir aşamada adacıklar terapötik etkinliği etkileyip etkilemediğini test etmek için genetik ya da farmakolojik olarak modifiye adacıklar kullanabilirsiniz. Allojenik ve otoimmün modelleri, adacık greft T-lenfositler, B lenfositler ve diğer bağışıklık hücrelerini içeren adaptif bağışıklık, ev sahibi tarafından belirli bir bağışıklık saldırıya maruz kalmaktadır. Adaptive-bağışıklık gecikmiş bir immün yanıt transplantasyon sonra tahlil bu yanıtı primer non-fonksiyon etkisini en aza indirmek için, erken bir aşamada normoglycemia geri adacıklar doyurarak sayısı nakli için gerekli. Adacıklar adacık greft reddi üzerine herhangi bir değişiklik etkilerini belirlemek için normoglycemia kaybı belirtilen reddedilir önce biri sonra süresini izleyebilirsiniz. Tecrübemizi, 300 adacık fazla 20 gram fare için gerekli olan ve 15 ila 21 gün donörler ve Balb / c kullanarak bir allojenik nakli için ret süresi (H-2 d) C57BL / 6 (H-2 b) alıcıları. Şekil 1 koledok duodenal açılış Konumlandırılması. Karaciğer drenaj Endojen sindirim enzimleri, pankreas ve safra kesesi, onikiparmak bağırsağı, bağırsak girmeden önce koledok geçmesi. Basıncı dış sıvı ekleyerek sisteme uygulanması durumunda, bu kanal vasıtasıyla akış yönü ters olabilir. Bu tam ve şişmiş olma pankreas neden olacaktır. Şekil 2 koledok duodenal açılış Sıkma. Liberase pankreas doldurmak için, koledok duodenal açılmasını engellemek için gerekli. Bu doğru değilse, Liberase pankreasın yerine bağırsakların dolduracaktır. Şekil 3 diyafram karşı karaciğer Repozisyonlama koledok proksimal bölge görselleştirme sağlar. (2.3.1 tarif V-şekilli birleştiği noktada yer) proksimal sonuna yakın teşebbüs ise koledok kanülasyonu, en başarılı bir şekilde elde edilebilir. Şekil 4 'serbest koledok Cannulatingel 'yöntemi. Onikiparmak bağırsağı üzerinde kenetli hemostat fare arka sonuna doğru çekildiğinde koledok bir izdiham görünür hale gelir. Kanal kanülasyon, 27 iğne yerleştirerek bu izdiham ve ile sürüş elde edilebilir. Şekil 5 koledok Cannulating yöntemi 'forseps yardımcı. De belirtildiği gibi metin, bazen kanalı çevreleyen fasyal doku zor cannulate yapar. (A), bu durumda, 27 gauge iğne ile yüz tabakasını temizlemek için yararlıdır. (B) kanalı sonra açıkça görüntülenebilmekte ve bir çift bükülmüş kol forseps tarafından desteklenen olabilir. (C) bir duraktır olarak forseps kullanarak, 27 gauge iğne Liberase teslimi için kanal içine eklenebilir. Şekil 6 pankreas bile genişleme optimal iğne yerleştirilmesi gösterir. Kanal ve fasyal dokuları çevreleyen saydam doğası gereği, bazı durumlarda aslında kanalı kanüle edildiğini görünebilir. Bu durum oluşursa ve iğne pankreas kapsül içine nüfuz ederse, pankreas duodenal bölgede Liberase teslim edildiği genişletmek için başlayacaktır. Ancak, tüm pankreas perfüze ve bu adacık verim düşük neden olacaktır. Bu sorunu önlemek için, pankreas, pankreas, mide ön kısmına ekli bölgeye giren enzim belirtileri için özellikle bakarak bile genişleme için izleyebilirsiniz. Şekil 7 perfüze pankreas kaldırılıyor. Fare pankreas kaldırmak için, iç organları ile temas birkaç noktada kırık olmalı. (AB), bağırsak, pankreas ayırın. (C) mide, pankreas ayırın. (D) bağırsak, pankreas ayırın. (EF) kalan periton boşluğuna ile herhangi bir temas kesin. Şekil 8 adacıklar Temsilcisi görüntüleri. Adacıklar göreli saflık ve kalite izolasyon prosedürü tamamlanması üzerine mikroskobik tahmin edilebilir. Amaç pankreas adacık arındırmak için (A), ekzokrin hücreleri ve enkaz bazen mevcut. (B) adacık izolasyon stres, adacık çevreden hücrelerinin dökülmesi adacıklar ve karanlık merkezi bölge olarak tezahür hücre ölümüne neden olabilir. (C), bir deney için adacıklar seçerken kirlenmesine neden olan dış salgı hücreleri toplama kaçının. (D) Islets kültür zaman görünümü değişir. Adacıklar izolasyondan kurtarmak gibi, onlar periferik pürüzsüz bir yüzey kazanır. Bazen büyük adacıklar karanlık bir merkezi bir bölgede görülebilir. Bu hücreler, hücre ölümü için olumlu bir leke. Post-izolasyon adacıklar Kilavuz video 1 Zaman atlamalı mikroskopi. Bu 16hr zaman atlamalı video adacıklar sonuçta çıkarılır nekrotik merkezleri gelişmekte görülebilir. Video için lütfen buraya tıklayınız .