Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

1. Preparação e calibração do reagente Liberase Este protocolo utiliza Liberase TL (Roche, Cat # 05 401 020 001) da enzima para a digestão do pâncreas. Compra de 100-200mg de cada vez e fazer um grande lote. Re-suspender pó liofilizado em água estéril grau HPLC modo que a concentração é de aproximadamente 26 unidades por ml Wünsch. Esta deve ser de aproximadamente 5 mg / ml. Consulte o folheto para obter detalhes sobre as unidades Wünsch contida no lote específico. Coloque os frascos no gelo por 30 minutos com gentile girando cada poucos minutos. Verificação para garantir o pó esteja completamente dissolvido no final de 30 minutos. Piscina todos os Liberase dissolvida e misture com agitação suave (NÃO vórtice ou shake). Unidades alíquota 24,3 Wünsch para tubos pré-refrigerados Eppendorph, congelar rápido em nitrogênio líquido (tratá-la como qualquer enzimas) e armazenar a -80 ° C. Esta deve ser de aproximadamente 0.935ml por tubo Eppendorph. Cada alíquota é para uso individual (suficiente para 11 ratos) e não deve ser armazenado ou re-congelados, uma vez descongelado. Em geral, o estoque é estável durante pelo menos 6 meses. Para cada novo lote, calibre o tempo de incubação ideal. Use o estoque de congelados, não o estoque recém-dissolvido, para a calibração, para imitar as condições reais experimental, tanto quanto possível. Calibrar o banho de água que você pretende usar a exatamente 37 ° C usando um termômetro de mercúrio. Use mesma incubadora em experimentos futuros. Antes do uso, descongelar um tubo de Liberase sobre o gelo e adicioná-lo (0.935ml) para 21.6ml soro livre RPMI, tornando a concentração final trabalhando 1,08 unidades por ml Wünsch. Soro, BAS e EDTA inibir Liberase. Zinco e cálcio são cofatores. Loja em gelo e use dentro de 1,5 horas. Isto é suficiente para cerca de 11 camundongos (2ml/mouse). Veja o passo 2.3 para perfusão pâncreas. Perfundir como ratos número possível em 1 hr. Em seguida, use um ou dois ratos para cada tempo de incubação eo teste 10, 12, 14, 16, tempos de incubação 18 minutos. Se possível, inclua intervalos de 30 segundos entre os tempos como o tempo de digestão é muito importante. Completar o protocolo de isolamento de ilhotas e analisar o rendimento de ilhotas e qualidade de cada ponto o tempo de incubação. Em última análise, o rendimento não deve mudar muito entre os horários de pico, mas a qualidade de ilhotas nesses intervalos podem variar. Para os experimentos subseqüentes, use as condições que resultam no maior número de ilhotas que são saudáveis ​​48 horas após o isolamento. A idade dos ratos parece afetar o tempo de incubação ideal. Então, use os ratos dentro de uma faixa etária semelhante. O ideal é usar ratos 12/08 semanas de idade, no entanto, mesmo 80-10 meses ratos velhos podem render bons ilhotas. Para fins de calibração, use ratos mais jovens. 2. Procedimento Cirúrgico Prepare todos os equipamentos e meios de comunicação antes de eutanásia os ratos de doadores de ilhotas. Autoclave ou chama esterilizar instrumentos antes do uso. Todos os reagentes e instrumentos (tocando as amostras) deve ser estéril. O isolamento ea colheita da mão de ilhotas pode ser realizado fora de uma capela de fluxo laminar sem aumentar a incidência de contaminação. No entanto, a esterilização de instrumentos que entram em contato com pâncreas ou ilhotas é fundamental para evitar a contaminação. As seguintes ferramentas são necessárias: Um par de tesouras de dissecação de incisão abdominal. 2 pares de fórceps. Uma pinça hemostática os apertar do ducto biliar. 0,419 milímetros de malha de arame de diâmetro. 0,1 milímetros de malha de nylon de diâmetro. Dobre várias agulhas 27, para que um ângulo de 70 graus é introduzido cerca de metade do comprimento da agulha. A borda chanfrada da agulha deve estar voltado para o interior do cotovelo. Encher uma garrafa de spray com etanol 70%. Configurar um microscópio de dissecação com uma fonte de luz adequada em uma bancada de laboratório ou em um capuz. Pré-chill centrífuga a 4 ° C. Centrífuga deve ter um balde rotor swing, ser capaz de 900xG, ser refrigerado e ter uma ruptura que pode ser desengatada. Em um Sorvall RT6000D com o H1000B Sorvall rotor, uma velocidade 900xG é 2400RPM. Gira mais lento são feitos em 800RPM. Coloque os seguintes reagentes no gelo. RPMI (1 litro de soro com 10%) RPMI (200ml sem soro) 50ml tubos cônicos (1 para cada pâncreas) Seringa de 5 ml. Equilibrar Histopaque1077 para o quarto temperatura. Descongelar uma alíquota de uso único de Liberase calibrados em gelo e diluir em soro 22.5ml livre RPMI. Soro, BAS e EDTA inibir Liberase. Zinco e cálcio são cofatores. Loja em gelo e use dentro de 1,5 horas. Isto é suficiente para cerca de 11 camundongos (2ml/mouse). Quente a 37 ° C banho-maria. Ter na mão como muitos ratos como você pode canular em 1 hora (aproximadamente 10-18 ratos). Prepare mouse para canulação. Primeira euthanize o mouse por deslocamento cervical ou asfixia CO 2. Enquanto o mouse está expirando, preencher a seringa de 5 ml com 2 ml de ações Liberase de trabalho (1,08 unidades Wünsch / ml). Colocar o mouse na posição supina sobre uma toalha de papel no escopo de dissecação e pulverizar o abdômen com álcool 70% antes de abrir seu abdômen com um V-incisão na região pubiana para ambas as pernas da frente. Da dobra da pele sobre o peito para revelar a cavidade abdominal. Posicione o mouse com a cabeça apontando para você. Localize a entrada duodenal do ducto biliar comum como em destaque na FIG.1. Isto pode ser feito sem olhar através objetivo âmbito de dissecação. Grampo da abertura duodenal com hemostat como demonstrado na Fig. 2. Posição grampo é fundamental para bloquear o fluxo de Liberase para o intestino. Se grampo é muito alta ou muito baixa, não vai Liberase perfundir o pâncreas. Hemostat posição, de modo que quando comprimido, ele vai exatamente ao longo da fronteira de pâncreas / intestino. Antes de canulação do ducto biliar comum, pode ser necessário reposicionar o fígado, pressionando-o contra o diafragma, de modo que todo o comprimento do ducto biliar comum está exposto (Fig. 3). Uma vez que o comprimento do duto biliar expostos, use a agulha 27 gague-dobrados anexado à seringa cheia Liberase para canulação. Existem duas técnicas para a canulação do ducto biliar. Na primeira técnica, ou método de 'mãos livres', a hemostat preso no duodeno é puxado para longe da cabeça do rato para a cauda para que o ducto biliar comum torna-se tenso. Há uma confluência no próximo ducto biliar para o fígado onde a bile de drenagem da vesícula biliar e as enzimas do fígado se reúnem antes de entrar no intestino. O interior do V formado por esta confluência é exposto puxando o ducto biliar apertado e é um lugar ideal para iniciar a canulação do ducto (Fig. 4). Se posicionado corretamente, a agulha irá deslizar para a direita através do V, e directamente canular a porção inferior do tubo. Inserir a agulha vários milímetros dentro do duto antes de dispensar o Liberase. Inserção da agulha ideal é importante para evitar refluxo para o fígado ea vesícula biliar. Além disso, é importante que a agulha não ser inserido tão longe que obstrui o duto esplênica. O duto do baço é um ramo difícil de ver do ducto biliar comum e drena a cauda do baço do pâncreas, uma área rica da ilhota. Se a agulha desliza passado a abertura para o canal do baço, haverá menos de perfusão completa da cauda do baço e digestão potencialmente reduzida desta área. Rendimento de ilhotas ideal ocorre quando a profundidade da agulha está longe o suficiente para que não Liberase escapa à bexiga fígado / vesícula, mas não tão longe que você passou o canal do baço. Você pode testar para canulação sucesso dispensando uma pequena quantidade de Liberase. Se você ver o Liberase enchimento do duto, em seguida, dispensar o resto do 2mls. Se a área em torno do ducto começa a encher, pare de distribuição, reposicionar a agulha, e tente novamente. Na segunda técnica, ou método 'forceps ajudar', o hemostat preso no duodeno é puxado para longe da cabeça do rato para a cauda para que o ducto biliar comum torna-se tenso. Então, usando a torto 27 gague-agulha acoplada à seringa de 5ml, perfurar a fáscia abaixo do ducto biliar comum perto do fígado. Use a agulha para limpar a fáscia do duto (fig.5). Com a agulha ainda no lugar, definir o hemostat para baixo e pegar um par de fórceps. Use um braço da pinça aberta para levantar o ducto biliar, onde a agulha limpou a fáscia. As cristas na forceps criar um aparelho que você pode usar para guiar a agulha para o duto. Ao puxar o duto e pinças para você, deslize a agulha dentro do duto utilizando o fórceps como um recuo. Teste para canulação dispensando uma pequena quantidade de Liberase. Se o duto começa a encher (fig.5 Arrow), dispense o resto do 2mls. Se a área em torno do ducto começa a encher, pare de distribuição, reposicionar a agulha e tente novamente. Como o 2mls de Liberase enche o pâncreas, a área perto do duodeno começa a se expandir em primeiro lugar, seguido pela região na parte superior do estômago e, finalmente, a cauda do baço (fig. 6). Procure mesmo a expansão do pâncreas (Fig.6). Se uma área começa a se expandir e você não vê o tecido branco uniformemente expandindo e se espalhando, é provável que o ducto biliar comum não foi canulada, ainda a agulha está dentro da cápsula pancreática. Enchendo a cápsula com Liberase não irá resultar em um rendimento de ilhotas de alta como a área de superfície exposta à enzima será baixo. Se isso ocorrer, pare de perfusão e reposicionar a agulha. Uma vez que o pâncreas foi perfundido, pode ser removida do rato puxando-livre a partir dos pontos de contacto com os intestinos, estômago e baço. Comece por retirar o hemostat do duodeno. Em seguida, use a pinça para levantar o duodeno e pâncreas de separar os intestinos com um segundo par de fórceps (FIG.7A-B). Isto é feito segurando o segundo par de fórceps constante enquanto puxa o intestino para fora do abdômen. Em seguida, puxe o pâncreas livre da parte superior do estômago e do baço (FIG.7C-D). Finalmente, levantar o pâncreas para fora do abdômen e cortá-la livre das conexões fascia restante (FIG.7E-F). Coloque o pâncreas em um tubo cônico de 50ml e deixá-lo no gelo, enquanto trabalhava no outros ratos. Iniciar um temporizador de 1 hora. Para o rendimento de ilhotas máxima, coloque apenas 1 pâncreas em cada tubo. Não é recomendado deixar a pancreata perfundidos no gelo por mais de uma hora, como o Liberase vai começar a degradar o tecido. No final da hora, imediatamente passar para o passo 3.0 para todos os pancreata que foram perfundidos. Repita os passos de 2,3-2,6 para os ratos restantes ou até que o temporizador de 1 hora começou em Passo 2,6 expirou. 3. Ilhotas de purificação da Pancreata perfundidos Antes de as ilhotas pode ser purificado a partir do pâncreas, o tecido deve ser digerido a 37 ° C. Grupo de 50ml tubos tendo as ilhotas perfundidas em um rack de fundo aberto que se encaixa no banho-maria 37 ° C. Assegurar que todas as tampas estão bem seguras e tubos de submergir no banho-maria 37 ° C para a quantidade precisa de tempo pré-determinado para o lote atual de Liberase (Veja o passo 1.4). No final da incubação, mover os tubos em gelo e adicionar RPMI1640 com 10% de soro para 20mls por tubo. Mídia contendo soro vai parar a digestão Liberase. Dissociar o tecido agitando os tubos vigorosamente 40 vezes em 10 segundos. Esta etapa é fundamental para a recuperação ideal de ilhotas. Mesmo com a perfusão Liberase ideal e tempo de digestão bem calibrados, o rendimento de ilhotas será baixo se o tecido não é quebrada. A manipulação agressiva das amostras nesta etapa não parece prejudicar o mouse e ilhotas é necessário libertá-los de grupos de células exócrinas. Para separar as ilhotas do pâncreas digerido, siga os seguintes passos. Piscina digerida pancreata de modo que há cerca de 2,5 pancreata por tubo. Ao fazê-lo, dez tubos serão condensadas em quatro tubos com 50mls de mídia cada. Centrifugar os tubos durante 2 minutos a 800RPM e 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 15 25mls mídia com FBS 10% em vortex suavemente (ajustar a intensidade de vórtice para aproximadamente 50% do máximo) durante vários segundos. Despeje a polpa ressuspenso através da tela de arame de 0,419 milímetros e funil para um tubo cônico de 50ml fresco. Isto separa os não-digerida tecido adiposo, e linfáticos. Lave o tubo inicial com um 10mls adicional de mídia contendo 10% FBS e despeje através da malha de arame. Repita esse processo para os tubos restantes. Centrifugue os tubos durante 2 minutos a 800RPM e 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante e inverter os tubos cuidadosamente sobre uma toalha de papel. Relógio para se certificar de que os ilhéus não escorregar. Limpe o interior dos tubos com uma toalha de papel para remover a mídia residual, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. Retorno tubos para uma posição vertical. Volte a suspender as pelotas no 5mls da temperatura ambiente histopaque1077 em vortex suavemente por alguns segundos. Garantir que a suspensão é homogênea antes de adicionar um adicional de 5mls Histopaque em todo o interior do tubo. Esta lava as ilhotas ao largo da parede do tubo. Sobreposição Histopaque com 10mls de soro livre RPMI, tendo o cuidado de manter uma interface bem definida entre o Histopaque e mídia. Adicionar a mídia por pipetagem lentamente para o lado do tubo a uma taxa de 1 ml por 10 segundos. A mídia deve estar no topo, e Histopaque na parte inferior. Soro afeta a densidade dos meios de comunicação e não deve ser usado durante esta etapa. Spin-amostras em uma centrífuga equilibrado a 20 ° C a 2400RPM (900xG) por 20 minutos com aceleração muito lenta e sem travagens. Este passo separa as ilhotas das células exócrinas. As ilhotas vai migrar para a interface entre a mídia livre e soro Histopaque enquanto as células exócrinas will formar um pellet no fundo do tubo. Recolher as ilhotas a partir da interface Histopaque / media com uma pipeta de 10ml descartáveis ​​sorológicos. Ilhotas vai ficar com o vidro, pipetas de vidro, portanto, não devem ser usados ​​a menos que tenham sido siliconizado. Lugar ilhotas em um tubo cônico de 50ml fresco. Vários tubos podem ser reunidas neste momento. Encher os tubos de 50ml com RPMI contendo soro. Centrifugar os tubos durante 2 minutos a 800RPM e 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante e ressuspender as ilhotas em 50mls de RPMI contendo soro em vortex suavemente. Centrifugue os tubos por 90 segundos a 800RPM e 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante e repetir lavar uma vez mais. Deitar fora o sobrenadante e levar os tubos para a capa de cultura de tecidos. Adicionar pen / strep para RPMI contendo 10% FBS a uma concentração final de 1% para tornar o meio de cultura das ilhotas. Volte a suspender as ilhotas em 5mls deste meio de cultura. Inverter uma peneira de nylon 0,1 milímetros de células e colocá-lo em um tubo de 15ml cônico. Lentamente passar a pasta ilhota ressuspenso através do filtro. As ilhotas será retida pelo filtro enquanto as células exócrinas passar por dentro do tubo de 15ml cônico. Esta etapa aumenta dramaticamente a pureza de ilhotas no que diz respeito à contaminação de células exócrinas, no final do protocolo. Lave o tubo cônico de 50ml com um 6mls adicionais de mídia e pipeta-lo através do filtro. 3mls lugar de meios de cultura como uma grande queda numa placa de Petri de 10 cm. Inverter a célula lado direito do filtro, de modo que a superfície usada para capturar as ilhotas podem ser mergulhados na gota de mídia. Tocando o filtro para a mídia irá transferir a maioria dos ilhéus em uma cultura não-tecido tratado placa de Petri. Usando um não-tratados placa de Petri é fundamental para evitar a adesão de ilhotas e dispersão à superfície da placa. Livre ilhotas flutuantes são muito mais facilmente escolhido para a separação em grupos experimentais. Pipetar um adicional de 5-7mls de meios de cultura através do filtro em placa de Petri para lavar qualquer ilhotas residual fora da peneira para o prato. Verificar o rendimento de ilhotas e de qualidade sob um objetivo 4x em um microscópio invertido. Agitando o prato em um oval apertado irá recolher as ilhotas no centro do prato. Se as ilhotas com bom aspecto, que pode ser escolhido imediatamente para uso experimental ou separados uniformemente entre 4-6 placas de petri 10 centímetros (por 10 ratos). Ilhotas de cultura demais no mesmo prato faz com que as ilhotas de se tornar necróticas e degradar. Para os experimentos, 250-300 ilhotas por seis centímetros prato com 2-3mls de mídia não parece sublinhar a ilhotas. Haverá algumas ilhotas utilizável no tubo de 15ml cónico que recolheu os 0,1 milímetros nylon fluxo de célula através de filtro. Estas ilhas podem ser recuperados na sequência 3-4 rodadas de sedimentação por gravidade. Depois de aproximadamente quatro minutos de sedimentação, aspirar tudo, mas cerca de 1 ml de mídia a partir do tubo e recarregá-lo até o topo com meios de cultura. Tampe o tubo e inverta para misturar. Repetir este processo várias vezes remove muitas das células exócrinas única célula que são lentos para sedimentos, e enriquece os agregados mais pesados ​​de células endócrinas (ilhotas) que rapidamente se afundar. Após a aspiração final, ressuspender em 7mls de meios de cultura e placa numa placa de Petri fresco. 4. Trabalhando com ilhotas isoladas O processo de isolamento é bastante estressante para as ilhotas; Histopaque é tóxico, agitação e centrifugação passos induzir tensão de cisalhamento, ea remoção da fonte de anfitrião de sangue, bem como a cultura in vitro pode induzir hipóxia. Nós e outros mostraram que o isolamento induz a morte das células beta 4-5. O efeito dessas tensões é visto pela descamação de células da periferia do ilhéu eo escurecimento e expulsão do núcleo central da ilhota (necrose central). Enquanto a descamação das células da periferia pode ser tolerada, a necrose central do ilhéu desqualifica-lo para uso em experimentos. Normalmente, quanto maior o ilhéu, maior a chance de necrose central será um problema. Esforços que visam reduzir o ilhéu de resposta ao estresse pós isolamento irá aumentar o rendimento de ilhotas utilizável. Por isso, usamos uma técnica anteriormente relatados de incubação das ilhotas de 22-27 ° C a cultura de tecidos para a primeira incubadora de 48-72 horas após isolamento 6-8. Esta temperatura reduzida atenua a resposta ao estresse ilhotas e suaviza sua transição para a cultura in vitro. Se um 22-27 ° C a cultura de tecidos incubadora não está disponível, é possível alcançar a faixa de temperatura desejada em um padrão de cultura de tecidos incubadora, desligando o controle de calor e colocando cerca de £ 20 detijolos freezer equilibrada a -80 ° C. Isto resulta em cerca de 16-24 horas de temperatura reduzida na incubadora. Substituir a -80 ° C tijolos freezer, conforme necessário. Não observamos um benefício adicional a partir da incubação nessa temperatura mais baixa mais de 72hrs. Além da baixa temperatura de incubação, recomendamos alterar os meios de comunicação de 24-48 horas após o isolamento. Fatores secretados das ilhotas estressado e mortos se acumulam no isolamento seguintes meios e pode promover estresse adicional ilhéu. Para alterar a mídia, siga os seguintes passos. Transferir a mídia e ilhotas da placa de Petri para um tubo de 15ml cônica com uma pipeta de plástico. Lave a placa com um 3mls adicional de meios de cultura para coletar ilhotas residual. Adicionar este 3mls adicionais para o tubo cônico 15ml e permitir ilhotas de sedimentos gravidade para 5min. Aspirar todos, mas 1ml de mídia do tubo cônico 15ml, então voltar a suspender as ilhotas em 4mls de meios de cultura ilhéu. Transferir os ilhéus e meios de comunicação para uma placa de petri fresco. Adicionar um 3mls adicional de meios de cultura para o tubo cônico 15ml para coletar qualquer ilhotas residuais e adicionar este à placa de petri. Troque a mídia ilhota a cada três a cinco dias depois. Ao escolher ilhotas para uma experiência, não é recomendável misturar ilhotas de isolamentos diferentes. A linha de base molecular das ilhotas é influenciado por muitas coisas, inclusive a quantidade de tempo que esteve presente na cultura e do estresse de isolamento que varia de preparação para prep. Para reduzir a variabilidade, as experiências de ilhotas devem ser executadas em ilhotas que foram isoladas, ao mesmo tempo. No entanto, se isso não for possível, nós sugerimos pooling todas as ilhotas em um único grupo antes de pegá-los para experiências. Para escolher ilhotas para experimentos, siga os seguintes passos. Se ilhotas estão incubando em mais de um prato, piscina todas as ilhotas em um prato único, seguindo os passos através 4.3.1 4.3.5 listados acima. Se vários pratos de ilhotas estão envolvidos, um tubo cônico de 50ml deve ser usado em vez do tubo de 15ml. Isto pode reduzir a variabilidade induzida por diferenças sutis em condições de cultura entre as placas durante o período de recuperação pós-isolamento. Durante sedimentos gravidade das ilhotas, configurar um microscópio invertido equipado com um objetivo de 4x ou 10x. Coletar uma micropipeta p200 e uma caixa de estéril p200 dicas. Transferência das ilhotas sedimentada a uma única placa e mover o prato para o microscópio. Redemoinho da placa para coletar as ilhotas no centro. Remova a tampa da placa e usar a pipeta p200 para escolher ilhotas saudável. Ilhotas saudáveis ​​têm fronteiras suave e não regiões centro escuro (Figura 8). Tente manter uma distribuição uniforme dos tamanhos das ilhotas ao longo pratos experimentais como o tamanho das ilhotas pode alterar a resposta ao tratamento. O número de ilhotas por grupo experimental pode variar de acordo com as necessidades do experimento. Nós estimamos que uma ilhota tem cerca de 1000-2000 células e renderá 0,3-1μg de proteína e 25 ng de RNA total. Para ensaios in vitro, um grupo experimental típico pode ser entre 100 e 250 ilhotas banhado em 35mm ou 6 centímetros pratos com 1-3ml de mídia. Para transplante, cada rato destinatário exigirá entre 150 e 400 ilhotas dependendo do projeto experimental (Veja o passo 5.2.2 e discussão para mais detalhes). Para minimizar as variações introduzidas pelo processo de mão direita, usamos o orifício da ponta p200-pipeta como um guia para estimar o tamanho das ilhotas. A maioria dos ilhéus têm um diâmetro de aproximadamente metade do diâmetro do orifício, e contamos com cada um deles como uma ilhota padrão. Qualquer ilhotas maiores ou menores do que isso, vamos atribuir uma contagem das ilhotas diferentes de acordo. Coletamos ilhotas em lotes de 20-50 e transferi-los para os pratos designado experimental. Se o p200-pipeta é de o volume de 180 microlitros, pode-se coletar várias ilhotas (normalmente mais de 50 ilhotas) em uma ponta. Assim, embora as ilhotas são escolhidos um a um, pode-se coletar muitas ilhotas dentro de cada p200 ponta, controlando o mecanismo de liberação Pipetman. Isso facilita a colheita de centenas ou mesmo mais de um milhar de ilhotas necessária para os experimentos. Nós também usamos esta operação de lote-sábio para ajudar a acabar com a distribuição de ilhotas com qualidade e dimensões semelhantes. 5. Kidney subcapsular Islet Transplantation Induzir diabetes em ratos receptor de transplante. Camundongos lugar em um rápido horas 4-6. Receptores de transplantes ideal deve ser entre 6 a 10 semanas de idade e pesam entre 20 e 25 gramas no tempo de jejum. Jejuar os ratos, retire o alimento da feeding rack e sempre colocar os ratos em uma gaiola nova. Isso garante um verdadeiro jejum, separando ratos de todos os bocados residual de alimentos que podem ter caído anteriormente sua gaiola. Plano para 80% a 90% de ratos a se tornar diabético. Após três horas de jejum, preparar o tampão citrato de sódio. Pesar 0.735g de citrato de sódio grau enzima (Na citrato, deputado 294,10 g / mol) e dissolvê-lo em 25mls de água deionizada estéril. Ajustar o pH para 4,5 usando HCl. Esta reserva deve ser feito fresco para cada rodada de experimentos. Colocar 0,05 g estreptozotocina (STZ, M r 265,2 g / mol) em um tubo de 1,5 ml Eppendorph. Este montante é suficiente para induzir diabetes em cerca de 8 ratos. Prepare um número adequado de tubos de 1,5 ml para o número de ratos para ser injetado. STZ é sensível à luz, assim que cubra cada tubo com papel alumínio. Após 4 horas de jejum, ressuspender um tubo de STZ com 1ml de recentemente feito Na tampão citrato. Uma vez ressuspenso, a solução citrato-Na STZ perde a atividade dentro de 15 a 20 minutos, pelo que este passo só deve ser feito imediatamente antes de injetar os ratos. Injectar cada intraperitoneal rato com um volume adequado de solução citrato-Na STZ para conseguir uma dose final de 190mg/kg mouse. Esta dose pode variar de acordo com a tensão ea idade do mouse; portanto, pode ser necessário realizar uma otimização de dose se a incidência de diabetes é muito baixo ou se os ratos muitos estão morrendo nos 3 a 5 dias após a injecção. Doses comuns utilizados variam de 150mg/kg rato para rato 250mg/kg. Fornecimento de alimentos e água uma vez todos os camundongos foram injetados. Camundongos teste para não-jejum de hiperglicemia (> 350mg/kg) 2 a 4 dias após a injeção. Camundongos que demonstram três dias consecutivos de jejum não hiperglicemia pode ser usado como receptores de transplantes. Prepare ilhotas para transplante Isolar ilhotas, como descrito acima em passos 2.0 a 4.0. Se necessário, as ilhotas podem ser isoladas no dia do transplante, ou antes. Escolha ilhotas em grupos para o transplante, colocando-os em tubos de 1,5 ml estéril Eppendorph. Mantenha os tubos no gelo. O número de ilhotas necessária para restaurar normoglicemia pode variar devido às condições do experimento (ilhotas de doadores tensão, peso e tensão do destinatário, e quaisquer tratamentos adicionais dado ao destinatário) ea pessoa que está escolhendo as ilhotas. O tamanho do mouse destinatário é uma variável importante que influencia o número de ilhotas mínima, como os ratos maiores exigirá ilhotas mais. Nós sempre achar que 150-250 ilhotas apenas marginalmente restaura normoglicemia enquanto 300 ilhotas ou mais é curativo em uma de 18 a 20gram C57BL / 6 do mouse destinatário. Nesses experimentos, os ratos doadores de ilhotas eram ou C57BL / 6 ou Balb / c. Ilhotas transplante renal subcapsular bolsa Montar os seguintes materiais (todos os instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados): Tabela 1. Equipamentos para Transplante 25μl Hamilton Seringa 6 "da PE 50 tubos flexíveis para cortar um lado está chanfrado Gel de carga e p200 ponteiras Estéril Eppendorph tubos (1 por beneficiário) Vaporizador de isoflurano e isoflurano Eppendorph tubo de rack McPherson Vannas-Tesoura (1) Bent fórceps braço (2) Hemostats (1) Clipe ferida com clips Agulha de calibre 27 Chama puxado sondas tubo capilar de vidro * Algodão ponta aplicadores 50ml tubo cônico de PBS estéril Suturas Shears elétrica Vaporizador 70% de etanol Caneta esferográfica Betadine drape plástico transparente estéril * Nota: Ao preparar essas sondas, tentativa de criar um arco na sonda que imita o ângulo do rim do rato. Além disso, assegurar que a extremidade da sonda está devidamente flamed polido para que não existem arestas cortantes. Pesar e etiquetar todos os ratos diabéticos destinatário. Atribuir a cada rato para um grupo experimental antes do transplante de modo que cada grupo tem igualmente acompanhado peso corporal. Configurar um campo cirúrgico dentro de um capô aberto equipado com a saída de gás do vaporizador isoflurano. Anestesiar um rato destinatário com isoflurano e, em seguida, raspar seu flanco com a tesoura elétrica. Shave o mouse fora da área onde o transplante será realizado. Retorno do mouse para anestesia e posicioná-lo deitado perpendicularmente e diretamente sobre o eixo de uma vareta de vidro para que o flanco raspada fica voltada para cima. Flanco pulverizador com Etanol 70%. O mouse deve ser preparado com um matagal cirúrgica de alternância betadine e álcool repetido três vezes. Drape o mouse com drape estéril claro de permitir o acesso ao flanco raspada. Prepare as ilhotas para o transplante enquanto o mouse está sendo anestesiada. Faça isso, preenchendo os seguintes passos. Coloque uma ponta de carga gel estéril na abertura de um tubo de 1,5 ml Eppendorph para que haja uma curva suave que faz uma forma de U na parte mais estreita da ponta. A abertura da ponta deve estar voltado diretamente para fora do tubo Eppendorph. Não introduzir uma torção em qualquer ponto na ponta de carga gel como isso vai resultar em ruptura das ilhotas e uma redução no número de ilhotas que são transplantadas. Remova cuidadosamente a partir de um tubo de gelo de ilhotas que foi preparado no passo 5.2.2. Todos os ilhéus devem ser resolvidas na parte inferior do tubo. Com uma pipeta p200, gentilmente coletar as ilhotas em um volume mínimo do fundo do tubo. Transferir essas ilhotas através da grande abertura da ponta de carga gel preparada no passo 5.3.6.1. As ilhotas deve se contentar em estreito o comprimento ou restrição estreita da ponta de carga gel. Após as ilhotas tiverem sedimentado, remover o máximo da mídia a partir da ponta de carga gel possível. Isso pode ser feito usando uma ponta de carga fresca gel ligado a uma pipeta p200, aspirando a mídia através da grande abertura da ponta de carga de ilhotas de rolamento gel. Transferência das ilhotas sedimentado na PE 50 tubos flexíveis (~ 15 centímetros de comprimento). Isto pode ser feito pela primeira anexando o final não chanfrada do tubo para a estreita abertura da ponta de carga de ilhotas de rolamento gel antes de colocar a ponta de uma pipeta p200. As ilhotas podem ser empurradas através de 60% do comprimento da tubulação. Transferência do ilhéu tendo PE 50 tubos a uma seringa Hamilton 25μl. Certifique-se o êmbolo da seringa tenha sido retirado antes de transferir o tubo. Conecte a extremidade não-chanfrado dos 50 PE tubulação para a agulha da seringa. O êmbolo da seringa até as ilhotas são de aproximadamente 0,5 centímetros de distância da abertura chanfrada. Coloque a seringa de lado para que as ilhotas podem resolver em uma única massa perto da abertura chanfrada do tubo, enquanto o rim está sendo preparado para receber as ilhotas. Usando seus dedos, localizar o rim através da pele do rato, sob anestesia. O eixo da caneta esferográfica devem ser directamente debaixo da área onde está localizado o rim e posicionado perpendicular à medula espinhal. Uma vez que o rim é localizada, use a tesoura McPherson-Vannas para fazer uma incisão dois centímetros através da derme diretamente acima dele em uma direção perpendicular à medula espinhal. Esta incisão irá expor na parede peritoneal. Com a tesoura McPherson-Vannas fazer uma incisão através da parede um centimetro peritoneal na mesma direção como o corte através da camada dérmica. É importante que a abertura criada por esta incisão ser menor do que o rim sendo expostos. Usando o eixo da vareta de vidro como uma proteção, força o rim através da abertura peritoneal, pressionando para baixo ªe superfície adjacente. Se a abertura é um pouco menor que o rim, o rim vai apertar através da abertura e descansar de forma estável na superfície do mouse, sem qualquer manipulação adicional ou contato. Este posicionamento é o ideal para as etapas subseqüentes transplante. Se a abertura é muito grande, o rim vai cair de volta na cavidade peritoneal, o que torna difícil concluir as etapas subseqüentes. Molhar a superfície do rim exposta com PBS estéril gelada usando um algodão embebido aplicador derrubado. Repita este passo a cada poucos minutos ou quando necessário para evitar a cápsula renal de secar. Utilizando a agulha de calibre 27, faça uma incisão 0,2 centímetros através da cápsula renal através da superfície anterior do rim em movimento do lado lateral esquerdo para o lado lateral direito. Usando a chama puxado sonda tubo capilar de vidro, criar uma bolsa entre a cápsula renal e parênquima renal. Fazê-lo através da inserção da sonda através da incisão feita no passo 5.3.12 e movê-lo em uma direção posterior ao longo da superfície dorsal-lateral do rim. Uma sonda ideal terá uma curva em que ela corresponde ao arco natural desta superfície do rim. Isso permitirá que a sonda chegar ao fim mais posterior do rim sem rasgar abrir uma grande abertura anterior. É importante fazer esta bolsa tão longa e estreita possível. Curto bolsas de largura não são ideais, pois permitem que ilhotas para escapar da cápsula. Bolsas longas e estreitas permitem as ilhotas a ser depositado em direção à extremidade posterior do rim com uma perda mínima da bolsa capsular. Recuperar a seringa Hamilton 25μl preparada no passo 5.3.6 e mover as ilhotas até à borda da abertura chanfrada do tubo flexível. Inserir a borda chanfrada do tubo flexível na bolsa subcapsular preparada no passo 5.3.13. A borda chanfrada deve estar voltado para cima, de modo que a borda longa está em contato com o parênquima renal. Mover o tubo até o fim mais posterior da cápsula. Lentamente, as ilhotas de transferência a partir do 50 PE tubo na bolsa subcapsular pressionando o êmbolo da seringa. Como as ilhotas encher a bolsa lentamente o tubo flexível para fazer mais espaço para as ilhotas de ser depositado. Garantir que todos os ilhéus são transferidos do tubo na bolsa. Não encha o saco com o ar ou o excesso de líquido. Depois de retirar o tubo de PE 50 da bolsa, use a chama puxado sonda tubo capilar de vidro para embalar suavemente as ilhotas na extremidade proximal da bolsa. Fazer isso, deslizando a sonda de vidro ao longo da superfície externa do rim se movendo em uma direção antero-posterior. Tenha cuidado para não embalar o ilhotas com muita força como a extremidade posterior da bolsa subcapsular pode se romper e liberar as ilhotas. Esta etapa minimiza a perda de ilhotas a partir da abertura anterior da bolsa quando o rim é colocado de volta no interior da cavidade peritoneal. Usando uma pinça braço dobrado levantar o revestimento peritoneal adjacente à abertura feita para o rim e, em seguida, use um algodão embebido PBS aplicador derrubado para empurrar cuidadosamente o rim de volta para a cavidade peritoneal. Fechar o mouse através da aplicação de suturas na parede peritoneal e clipes ferida na camada dérmica. Devolver o mouse para sua gaiola e repita os passos 5.3.4 através de 5.3.19 para os ratos restantes. Ratos devem ser mantidos aquecidos com uma almofada de aquecimento debaixo da gaiola ou uma lâmpada de aquecimento com os olhos protegidos até que o mouse se recupera totalmente da anestesia. Os animais devem ser fornecidos com acetominophine na água (6 mg / mL). Verificação não-jejum os níveis sanguíneos de glicose 24 horas mais tarde. Todos os animais devem ser normoglicêmicos (glicemia <200mg/dl) no pós-operatório dia (POD) 1. 6. Resultados representante Dois procedimentos principais são descritas neste protocolo: (1) o isolamento de ilhotas e (2) transplante de ilhotas sob a cápsula renal. No procedimento de isolamento das ilhotas, o rendimento de ilhotas variam tipicamente entre 100-150 ilhotas por rato, dependendo da idade e tensão. A pureza dessas ilhotas em relação a sua separação das células exócrinas do pâncreas pode variar muito entre cada preparação. No entanto, o uso de Histopaque1077 temperatura ambiente no passo 3.3.7 e um filtro de nylon 0,1 milímetros no passo 3.3.17 geralmente permitem a mais de 99% de pureza de ilhotas. Essa pureza é alcançada antes de qualquer colheita da mão adicional de ilhotas. Imagens representativas do isolamento ilhotas seguintes são mostrados na Figura 8D. Como pode ser visto nestas imagens, os ilhéus têm normalmente uma margem aproximada de isolamento periférico imediatamente seguinte. No entanto, com o tempo em cultura, ilhotas saudável irá adquirir e manter uma borda lisa (Figura 8D). Em algumas ilhotas, uma região central necrótica vai desenvolver,aparecendo como uma área escura no núcleo. Este centro necrótico é muitas vezes expulso do ilhéu como capturado pelo tempo-lapso de imagem (Supplemental Video 1). As ilhotas restantes parecem ocos no centro (dados não mostrados) e, presumivelmente, não funcional. Assim, excluímos ilhotas com centro escuro durante o processo de colheita da mão. Importante, descobrimos que uma baixa temperatura de incubação após o procedimento de isolamento (Passo 4.2) pode reduzir drasticamente o número de ilhotas que irão desenvolver necrose central na cultura ao longo do tempo. No procedimento de transplante de ilhotas, dois passos são fundamentais: indução química de diabetes e entrega de ilhotas ao rim área de sub-cápsula. Para a indução do diabetes, a meta é atingir hiperglicêmico em mais de 90% da STZ camundongos injetados. Esses camundongos irá sobreviver sem o transplante por várias semanas. A dose ideal de STZ para atingir esse objetivo varia, dependendo linhagens de camundongos e idade, e deve ser determinado pelo experimentalmente. Descobrimos que uma diferença tão pequena quanto 20mg/kg de peso corporal pode fazer uma grande diferença. Assim, a titulação com intervalos estreitos devem ser realizadas. Para transplante de ilhotas, uma questão fundamental é a modelos, que podem ter quatro contextos imunológica: singênico, alogênico, auto-imunes singeneicos e alogênico auto-imunes. No modelo singênico, a estirpe do doador é o mesmo que a tensão destinatário. Assim, os ilhéus não invocar a resposta adaptativa imune junto dos beneficiários. Isso permite que os pesquisadores para investigar as questões relacionadas com "função primária não", um termo referente a ilhota disfunção e perda devido a outros motivos que não a rejeição imunológica específica por parte dos beneficiários. Função não-primário é pensado para ser o principal motivo para o fracasso das ilhotas na fase de transplante precoce e para a exigência de um grande número de ilhotas (≥ 2 pancreata / paciente) para alcançar euglicemia. Assim, é uma questão crítica para transplante de ilhotas. Neste modelo, uma massa de ilhotas marginal que não restaurar completamente normoglicemia deve ser usado e os ratos devem ser examinados para glicose no sangue na fase inicial após o transplante, normalmente entre 1 a POD POD 7. Em nossa experiência, uma massa marginal de ilhotas é tipicamente entre 150 e 250 ilhotas de tamanho médio por 20 gramas de destinatário usando a cepa C57BL / 6 de camundongos. Com o modelo singênico, pode-se usar geneticamente modificados ou farmacologicamente ilhotas para testar se uma modulação particular afeta a eficácia terapêutica das ilhotas na fase inicial após o transplante. Nos modelos alogênico e auto-imunes, os enxertos de ilhotas são expostos a um ataque imune específica pelo hospedeiro-imunidade adaptativa, que envolve linfócitos T, linfócitos B, células do sistema imunológico e outros. Adaptive-imunidade é uma resposta atrasada imunológico; ensaio para essa resposta, é necessário um número de transplantes de ilhotas saturando que efetivamente restaura normoglicemia na fase inicial após o transplante para minimizar o impacto da função primária não. Pode-se então monitorar o período de tempo antes das ilhotas são rejeitados, conforme indicado pela perda de normoglicemia para determinar os efeitos de qualquer modificação de ilhotas na rejeição do enxerto. Em nossa experiência, superior a 300 ilhotas são necessários para cada 20 gramas do mouse e de 15 a 21 dias são o tempo de rejeição para um transplante alogênico usando Balb / c (H-2 d) como doadores e C57BL / 6 (H-2 b) como destinatários. Figura 1. Localizando a abertura duodenal do ducto biliar comum. Enzimas digestivas endógenas de drenagem do fígado, pâncreas e vesícula biliar passar através do ducto biliar comum antes de entrar no trato intestinal no duodeno. A direção do fluxo através desse canal pode ser revertida se a pressão é aplicada ao sistema pela adição de fluido externo. Isso resultará no pâncreas tornando-se completa e distendida. Figura 2. Fixação da abertura duodenal do ducto biliar comum. A fim de preencher o pâncreas com Liberase, é necessário para bloquear a abertura duodenal do ducto biliar comum. Se isso não for alcançado corretamente, Liberase vai encher os intestinos em vez do pâncreas. Figura 3. Reposicionamento o fígado contra o diafragma permite a visualização da região proximal do ducto biliar comum. Canulação do ducto biliar comum pode ser alcançado com mais sucesso, se é tentado próximo a sua extremidade proximal (na confluência V-shaped descrito em 2.3.1). Figura 4. Canulação do ducto biliar comum pela livre "método de mão '. Uma confluência do ducto biliar comum se torna visível quando o hemostat que é fixada sobre o duodeno é puxado em direção à extremidade posterior do mouse. Canulação do duto pode ser feito colocando a agulha calibre 27 a esta confluência e dirigir através dela. Figura 5. Canulação do ducto biliar comum pelo "forceps ajudar 'método. Como mencionado no texto, às vezes o tecido fascial em torno do duto torna difícil canular. (A) Nestes casos, é útil para limpar a camada facial com a agulha de calibre 27. (B) O duto pode ser claramente visualizado e apoiado por um par de fórceps braço dobrado. (C) Usando a pinça como um recuo, a agulha de calibre 27 pode ser inserido dentro do duto para a entrega de Liberase. Figura 6. Até a expansão do pâncreas indica a colocação de agulha ideal. Dada a natureza translúcida do duto e tecidos fasciais, em alguns casos, pode parecer que o duto foi canulada, quando na verdade ele não tem. Se isso ocorrer, a agulha penetra na cápsula pancreática, a região duodenal do pâncreas começará a se expandir no momento da entrega do Liberase. No entanto, o pâncreas inteiro não serão perfundidos e isso vai resultar em rendimento de ilhotas baixas. Para evitar esse problema, para assistir ainda a expansão do pâncreas pela especificamente à procura de sinais de enzima entrar na região do pâncreas ligado à porção anterior do estômago. Figura 7. Remoção do pâncreas perfundido. Para remover o pâncreas do mouse, vários pontos de contacto com as vísceras, deve ser quebrado. (AB) Separe o pâncreas a partir do intestino. (C) Separar o pâncreas do estômago. (D) Separe o pâncreas a partir do intestino. (EF) Cut contatos restantes com a cavidade peritoneal. Figura 8. Imagens representativas de ilhotas. A pureza relativa e qualidade das ilhotas pode ser estimado microscopicamente após a conclusão do procedimento de isolamento. (A) Quando o objetivo é purificar ilhotas do pâncreas, as células exócrinas e detritos são ocasionalmente presente. (B) O estresse de isolamento de ilhotas pode induzir a morte celular que se manifesta como escuras regiões centrais das ilhotas e descamação de células da periferia das ilhotas. (C) Ao escolher ilhotas para um experimento, evite pegar as células exócrinas contaminantes. (D) Ilhotas mudança na aparência com o tempo em cultura. Ilhotas como recuperar de isolamento, eles adquirem uma superfície lisa periférica. Ocasionalmente em ilhotas maiores uma região escura central é visível. Estas células coloração positiva para a morte celular. Suplementar Video 1. Tempo microscopia lapso de pós-isolamento ilhotas. Neste vídeo 16hr lapso de tempo as ilhotas podem ser vistas a desenvolver centros necróticos que são em última instância ejetado. Por favor, clique aqui para o vídeo .