マウス膵島の単離と被膜下腎移植のための方法

1。リベラーゼ試薬の調製とキャリブレーションこのプロトコルは、リベラーゼTL（ロシュ、猫＃05 401 020 001）膵臓の消化酵素を利用しています。 一度に100 – 200mgを購入し、大規模なバッチ処理を行います。濃度はmlあたり約26ワンチの単位になるように滅菌HPLCグレードの水の凍結乾燥粉末を再サスペンド。これは約5 mg / mlのはずです。特定のロットに含まれているワンチユニットの詳細については添付文書を参照してください。数分ごとに渦巻く異邦人との30分間氷上にバイアルを置きます。粉が完全に30分の終わりに解散されるように確認してください。 プールは、すべて一緒にリベラーゼを溶解し、（ボルテックスまたは振らないでください）​​穏やかな旋回で混ぜる。あらかじめ冷却Eppendorph管、液体窒素で急速凍結（いかなる酵素として扱う）、-80℃で保存へのアリコート24.3ワンチユニットこれはEppendorphチューブあたり約0.935ミリリットルでなければなりません。各アリコートを、単一の使用のためです（十分な11マウス用）と保存されたり、再凍結解凍は1回ではありません。一般的に、株式は少なくとも6ヶ月間安定です。 それぞれの新しいバッチの場合は、最適なインキュベーション時間を校正する。可能な限り実際の実験条件を模倣するために、キャリブレーションのために、凍結ストックではなく、新鮮な溶存株式を使用してください。 あなたが° C水銀温度計を使用して正確に37に使用する予定の水浴をキャリブレーション。将来の実験で同じインキュベーターを使用してください。 使用前に、氷上リベラーゼのチューブを融解し、最終的な作業濃度mlあたり1.08ワンチユニット作り、21.6ミリリットルの無血清RPMIにそれ（0.935ミリリットル）を追加します。血清、BASとEDTAはリベラーゼを阻害する。亜鉛とカルシウムの補助因子です。 1.5時間内で氷と使用上のストア。これは約11マウス（2ml/mouse）には十分です。 膵臓の血流のために2.3を手順を参照してください。 1時間でできるだけ多くのマウスとして灌流。次に、各インキュベーション時間および試験10 1つまたは2つのマウス、12、14、16、18分のインキュベーション時間を使用してください。可能であれば、消化のタイミングが非常に重要であるとして時間の間に30秒間隔などがあります。 膵島分離プロトコルを完了し、各培養時間の点から膵島の収量と品質を分析する。最終的に収率は、ピーク時間の間にあまり変更すべきではありませんが、それらの間隔で膵島の品質が異なる場合があります。その後の実験のために、分離後の健康な48時間ある小島の最大数の結果という条件を使用してください。マウスの年齢は、最適なインキュベーション時間に影響を与えるように見えます。ので、同じような年齢の範囲内でマウスを使用してください。理想的には、8-12週齢のマウスを使用しますが、さらに80〜10カ月齢のマウスは良い膵島を得ることができます。キャリブレーションの目的のために、若いマウスを使用してください。 2。外科手術膵島ドナーマウスを安楽死前にすべての機器およびメディアを準備します。 オートクレーブや火炎は使用前に機器を滅菌する。すべての試薬や器具は、（サンプルに触れる）無菌でなければなりません。膵島の分離と、手摘みが大幅に汚染の発生率を増加させることなく、層流フードの外で行うことができます。しかし、膵臓または膵島と接触するツールの滅菌は、汚染を避けるために重要です。次のツールが必要です： 腹部切開用はさみを解剖1組。 鉗子の2組。 胆管をオフクランプするには、1止血鉗子。 0.419ミリメートルの直径のワイヤーメッシュ。 0.1mmの直径のナイロンメッシュ。 70度の角度が針の長さに沿って約半分に導入されるように、いくつかの27ゲージの針を曲げます。針のベベルエッジは肘の内側を向くようにします。 70％エタノールでスプレーボトルを埋める。 ラボのベンチ上やボンネット内の適切な光源を解剖顕微鏡を設定します。 4℃に事前チル遠心遠心分離機は、スイングバケットローターを持っている900xGことができなければ、冷蔵保存されている、と外れることができるブレークを持っている必要があります。ソーバルH1000BローターでRT6000Dソーバルでは、900xG速度は2400RPMです。遅いスピンは約800 rpmで行われます。 氷上で以下の試薬を置きます。 RPMI（10％血清を1リットル） RPMI（血清を含まない200ミリリットル） 50ミリリットルコニカルチューブ（各膵臓1） 5ミリリットル注射器。 部屋テンペにHistopaque1077を平衡化rature。 氷の上で校正されたリベラーゼの単独使用のアリコートを解凍し、22.5ミリリットル血清を含まないRPMIで希釈。血清、BASとEDTAはリベラーゼを阻害する。亜鉛とカルシウムの補助因子です。 1.5時間内で氷と使用上のストア。これは約11マウス（2ml/mouse）には十分です。 暖かい37℃の水浴。 （ – 18マウスの約10）が1時間にカニューレを挿入することができるように多くのマウスとして、手に持っている。 カニュレーションのためのマウスを準備します。最初の頸椎脱臼やCO 2窒息によりマウスを安楽死させる。マウスが期限切れしている間、2ミリリットルリベラーゼ作業用ストック（1.08ワンチ単位/ ml）で5ミリリットル注射器を埋める。 場所の解剖スコープでペーパータオルの上で仰臥位でのマウスと両方前足に陰部からV -切開でその腹部を開く前に、70％エタノールで腹部をスプレー。腹腔を明らかにするために胸の上に倍の皮膚。 あなたの方を向いて頭にマウスを置きます。図1に強調表示された総胆管の十二指腸エントリを探します。これは、解剖範囲の目標を見することなく行うことができます。 図2に示すように止血剤と十二指腸開口部をクランプする。クランプの位置は、腸内リベラーゼの流れを遮断するために重要です。クランプが高すぎるまたは低すぎる場合は、リベラーゼは膵臓を灌流されません。位置の止血剤は、そのように圧縮したとき、それは膵臓/小腸国境に沿って正確に実行されます。 総胆管をcannulatingする前に、それは総胆管の全長が（図3）露出するように、ダイアフラムに対してそれを押すことで肝臓の位置を変更する必要があるかもしれません。露出胆管の長されれば、カニュレーションのための注射器をいっぱいにリベラーゼに接続された曲がり27 gagueの針を使用してください。胆管をcannulatingための2つの方法があります。 最初の手法、または"フリーハンド"の方法では、止血剤は総胆管をピンと張るになるように十二指腸を尾に向かってマウスの頭から外れているにクランプ。胆汁が腸に入る前に一緒に来て肝臓から胆嚢と酵素から排出する肝臓の胆管の近くで合流があります。この合流によって形成されるVの内部には、タイトな胆管を引いて、露出と（図4）ダクトのカニュレーションを開始する理想的な場所です。正しく配置する場合、針はVを介して右にスライドさせ、そして直接ダクトの下部にカニューレを挿入するでしょう。リベラーゼを調剤する前にダクトに針数ミリメートルを挿入します。最適な針の配置は、肝臓と胆嚢に逆流を防止するために重要です。さらに、針はこれまで、脾臓のダクトを妨げることが挿入されないことが重要です。脾臓のダクトは、総胆管の分岐を確認することは困難であり、膵臓、膵島豊かな地域の脾臓尾を排出する。針は、脾臓のダクトの開口部を越えてスライドする場合、脾臓尾の完全な血流とこの地域の潜在的に減少する消化よりもあるでしょう。最適な膵島の収量は、針の深さが十分ないリベラーゼはこれまでのところでは、脾臓のダクトを通過したことを肝臓/胆嚢にエスケープしないではないという場合に発生します。あなたはリベラーゼの少量を分注することによって成功したカニ​​ュレーションをテストできます。あなたがダクトを充填リベラーゼが表示された場合はその後2mlsの残りを分注する。ダクト周辺が満杯になり始める場合、、調剤停止針の位置を変更し、再試行してください。 第二の技術、または"鉗子アシスト"方式では、止血剤は総胆管をピンと張ることとなるような尾に向かってマウスの頭から外れている十二指腸にクランプ。その後、5ミリリットル注射器、穿刺肝臓に総胆管の近くに下筋膜に接続された曲がり27 gague針を使用して。ダクト（図5）から筋膜をクリアするために針を使用してください。まだ場所の針で、止血剤を下に設定し、鉗子のペアを拾う。針が筋膜をクリアした胆管を持ち上げ、開いた鉗子の片方の腕を使用してください。鉗子の尾根では、ダクトに針を導くために使用できる道を作る。あなたに向かってダクトや鉗子を引っ張りながら、バックストップとして鉗子を使用してダクトに針をスライドさせます。リベラーゼの少量を分注することによりカニュレーションのためのテスト。ダクトが満杯になり始める（図5矢印）の場合、2mlsの残りを分注する。ダクト周辺が満杯になり始める場合、、調剤停止針の位置を変更して再試行してください。 リベラーゼの2mlsは膵臓、十二指腸は胃の上の領域、そして最終的に脾臓尾（図6）に続いて、最初に拡大し始める付近を埋めるように。膵臓のにも拡大（図6を探します）。つの領域が拡大を開始して、白いティッシュが均等に拡大して広がって表示されていない場合、それは総胆管をカニューレを挿入されていない可能性があります、まだ針は、膵臓のカプセル内にあります。酵素にさらされる表面積が低くなるのでリベラーゼでカプセルに充填する高膵島収量にはなりません。この問題が発生した場合、血流を停止し、針の位置を変更します。 膵臓が灌流されると、それは腸、胃、脾臓との接触のポイントから自由に引いて、マウスから削除することができます。十二指腸から止血剤を除去することによって開始します。その後、十二指腸を持ち上げると鉗子（FIG.7A – B）の2番目のペアで腸から膵臓を分離するために鉗子を使用する。これは、腹部から腸を引き出しながら、鉗子の2番目のペアを固定することによって行われます。次に、胃の上部と脾臓（FIG.7C – D）から無料で膵臓を引き出します。最後に、腹部の膵臓を持ち上げ、残りの筋の接続（FIG.7E – F）から無料でそれをカット。 他のマウスでの作業中に50ミリリットルコニカルチューブで膵臓を置き、氷の上に置いたまま。 1時間のタイマーを開始します。最大の膵島収量の場合は、各チューブには1膵臓を置きます。リベラーゼが組織を分解し始めるので以下は、1時間以上氷上に灌流された膵臓を残すことは推奨されません。時間の終​​わりには、速やかに灌流されたすべての膵臓に3.0をステップに移動します。 2.6残りのマウスのためか、ステップ2.6で開始1時間のタイマーが切れるまで – 手順2.3を繰り返します。 3。灌流膵臓から精製するランゲルハンス島島が膵臓から精製される前に、組織を37℃で消化する必要があります。 37℃の水浴に収まるオープンボトムのラックで灌流した膵島を軸承集団50ミリリットルチューブ。すべてのキャップはよく（ステップ1.4参照）リベラーゼの現在のバッチのために事前に決定を確保し、時間の正確な量の37℃の水浴中で水没管されていることを確認します。インキュベーションの終了時に、氷にチューブを移動し、チューブごと20mlsに10％血清でRPMI1640を追加します。血清含有培地は、リベラーゼの消化を停止します。 10秒で精力的に40回チューブを振って、組織の関連付けを解除します。このステップでは、膵島の最適な回復にとって重要です。組織が分割されていない場合であっても最適なリベラーゼの血流と密接に校正された消化の時間で、膵島収量が低くなります。このステップでは試料の積極的な処理は、マウスの膵島を害するおそれが表示され、外分泌細胞クラスターからそれらを解放するために必要なのです。 消化膵臓から膵島を分離するには、次の手順を実行します。 チューブあたり約2.5膵臓があるようにプールには、膵臓を消化。そうすることで、10管は、メディアごとの50mlsで4管に凝縮されます。 約800 rpm、4℃で2分間、チューブを遠心℃に上清を捨て、数秒間（最大値の約50％に渦の強さを調整する）穏やかにボルテックスで10％FBS、15 – 25mlsメディアでペレットを懸濁します。 新鮮な50ミリリットルコニカルチューブに0.419ミリメートルのワイヤメッシュと漏斗で再懸濁したスラリーを注ぐ。これは、非消化組織、脂肪とリンパ節を分離。 10％FBSを含むメディアの追加10mlsで最初のチューブをリンスし、金網を通して注ぐ。残りのチューブについて、この手順を繰り返します。 約800 rpm、4℃で2分間、チューブを遠心℃に上清を捨て、慎重にペーパータオル上でチューブを反転させる。島がオフにスライドしていないことを確認してご覧ください。細胞ペレットを乱さないように注意しながら、残存メディアを削除するには、ペーパータオルで試験管の内側を拭きます。直立の位置にチューブを返します。 数秒のために穏やかにボルテックスして室温histopaque1077の5mlsでペレットを再懸濁します。懸濁液が管の内側の周りhistopaqueの追加5mlsを追加する前に均質であることを確認してください。これは管の壁から島を洗浄する。 無血清RPMIの10mlsとオーバーレイはhistopaque、histopaqueとメディアとの間のシャープな界面を維持するように注意して。 10秒ごとに1ミリリットルの割合で管の側をゆっくりとピペッティングすることによりメディアを追加します。メディアが上になる、と底にhistopaqueてください。血清は、メディアの密度に影響を与え、この工程中に使用しないでください。 ブレーキングが非常に遅い加速となしで20分間2400RPM（900xG）で20℃に平衡化した遠心機でサンプルをスピン。このステップでは、外分泌細胞からの膵島を分離。小島はwi外分泌細胞間無血清培地とHistopaqueとの間のインタフェースに移行されますチューブの底にペレットを形成しています。 使い捨て10ミリリットル血清用ピペットでhistopaque /メディアインタフェースからの膵島を集める。小島は、ガラスに付着するので、それゆえ彼らはシリコン処理されていない限り、ガラスピペットは使用しないでください。新鮮な50ミリリットルコニカルチューブに島を置きます。いくつかのチューブは、この時点でプールすることができます。血清を含むRPMIを50ミリリットルにチューブを埋める。 約800 rpm、4℃で2分間、チューブを遠心℃に上清を捨て、軽くボルテックスで血清を含むRPMIの50mlsで島を懸濁します。 約800 rpm、4℃で90秒間チューブを遠心℃に上清を捨て、1より多くの時間を洗う繰り返す。 上清を捨て、組織培養フードにチューブを取る。膵島培養培地を作るために終濃度1％に10％FBSを含むRPMIにペン/連鎖球菌を追加。この培地の5mlsで島を再懸濁します。 0.1ミリメートルのナイロンセルストレーナーを逆さにして15ミリリットルコニカルチューブの上に置きます。ゆっくりストレーナーを通して再懸濁した膵島スラリーを渡します。外分泌細胞は、15ミリリットルコニカルチューブに通過しながら島をストレーナーで保持されます。このステップでは、劇的にプロトコルの終了時に外分泌細胞の汚染に対して、膵島の純度を向上させます。 メディアの追加6mlsで50ミリリットルコニカルチューブをリンスし、ストレーナを介してピペット。 10cmのペトリ皿の大規模なドロップのような培地の3mls場所。膵島をキャプチャするために使用される面がメディアドロップに浸漬することができるように、セルストレーナー右側を反転。メディアにフィルタをタッチすると、シャーレを扱う非組織培養に島の大部分を転送します。無処理のペトリ皿を使用すると、プレートの表面に膵島密着性と分散を避けるために重要です。フリーフローティング島ははるかに容易に実験的なグループに分離するために選ばれている。 皿にストレーナーの残存島を洗い落とすためにシャーレにストレーナーを通して培地の追加5 7mlsをピペット。 倒立顕微鏡上で4倍目標の下で膵島収量と品質を確認してください。タイトな楕円形の皿を旋回すると、皿の中央に島を収集します。島が良い見れば、彼らはどちらか実験的な使用のためにすぐに取得さまたは4月6日10センチメートルペトリ皿（10匹あたり）に均等に分離することができます。同じ皿で培養あまりにも多くの島は、島が壊死し、劣化状態にします。実験については、メディアの2 3mlsと6 cmディッシュあたり250から300の島が島を強調して表示されません。 経由で0.1ミリメートルのナイロンセルストレーナーのフローを収集した15ミリリットルコニカルチューブの一部の使用可能な島があるでしょう。これらの島は、重力沈降、3〜4ラウンドに続く回復することができます。培地で一番上に堆積の約4分後、すべての吸引が約チューブからメディアを1mlと補充。チューブにフタをし、混在させる反転。このプロセスを数回繰り返すと、堆積物に遅い場合、単一の細胞外分泌細胞の多くを取り除く、そして豊かにすぐにシンクの内分泌細胞（膵島）の重い骨材を。最終的に吸引した後、新鮮なペトリ皿で​​培養培地とプレートの7mlsに再懸濁します。 4。絶縁ランゲルハンス島での作業分離のプロセスは、膵島でかなりのストレスです。histopaqueは有毒であり、振って、遠心分離のステップは、薄手のストレスを誘発し、in vitro培養と同様にホストの血液供給からの除去は、低酸素症誘発することができます。我々と他の分離は、β-細胞死4-5を誘導することが示されている。これらのストレスからの影響は、膵島の周辺から細胞の脱落と暗くなると島の中央のコア（中心壊死）の追放によって見られている。周囲からの細胞の脱落は許容できる一方で、膵島の中心壊死は、実験で使うためにそれを与えないこととする。一般的に、より大きな島、中心壊死が問題となる可能性が高くなります。膵島のポスト分離ストレス応答の削減を目指した取り組みが可能な膵島の収量が増加します。 したがって、我々は分離6月8日に続く最初の48〜72時間22〜27℃の組織培養インキュベーター内膵島を培養することの以前に報告されたテクニックを使用してください。この減少温度は、島のストレス反応を鈍らせるとin vitro培養への移行をスムーズにします。 22〜27℃の組織培養インキュベーターが利用できない場合、それは熱のコントロールをオフにし、約20ポンドの配置することにより、標準的な組織培養インキュベーターで所望の温度範囲を達成することが可能です。-80〜平衡冷凍庫のレンガ℃のインキュベーターの温度が下がるのは約16 24時間でこの結果。必要に応じて-80℃の冷凍庫のレンガを交換してください。我々は72時間よりも長くこの低い温度でのインキュベーションから追加の利点を確認されていません。 低温のインキュベーションに加えて、我々は分離した後、メディア24-48時間を変更することをお勧めします。ストレスと死んで膵島から分泌される要因はメディア、以下の分離に蓄積され、追加の膵島のストレスを促進することができます。メディアを変更するには、次の手順を実行します。 ペトリ皿からプラスチック製のピペットを用いて15ミリリットルコニカルチューブにメディアと島を転送します。 残留膵島を収集するために培地の追加3mlsでプレートを洗浄してください。 15ミリリットルコニカルチューブにこの追加の3mlsを追加し、5分のための重力沈降する島が可能になります。 15ミリリットルコニカルチューブからのメディアのすべてが1ミリリットルを吸引し、膵島培養培地の4mlsで島を懸濁します。 新鮮なペトリ皿に小島とメディアを転送する。任意の残留島を収集し、ペトリ皿にこれを追加するには、15ミリリットルコニカルチューブに培地の追加3mlsを追加。 3〜5日後膵島のメディアを変更します。 実験のために島を選ぶとき、それは別のアイソレーションから膵島を混在させることは推奨されません。膵島の分子ベースラインは、彼らが文化にされている時間の量と準備から準備して変化する分離ストレスを含む、多くの物事に影響されます。ばらつきを減らすために、膵島実験を同時に分離した膵島を実行する必要があります。しかし、これが不可能な場合、我々は強く前に実験のためにそれらを拾いに単一のグループにすべての島をプールすることを示唆している。実験のために島を選択するには、次の手順を実行します。 小島は、上記の4.3.5を介して手順4.3.1に従ってすべての膵島単皿にプール、複数の皿の中でインキュベートされている場合。膵島の複数の料理が含まれる場合は、50ミリリットルコニカルチューブは、15ミリリットルチューブの代わりに使用する必要があります。これは後の絶縁回復期間中に、プレート間の培養条件の微妙な違いによって誘発されるばらつきを減らすことができます。 島の重力沈降の間に、4倍または10倍の目標を装備した倒立顕微鏡を設定します。 P200のマイクロピペットと滅菌P200チップの箱を集める。 単板に沈降した膵島を転送し、顕微鏡にプレートを移動する。渦巻板は中央に島を収集する。プレートに蓋を取り外して、健康な島を選択するP200のピペットを使用してください。健康な島は、滑らかなボーダーとなく暗い中央の領域（図8）がある。膵島の大きさなどの実験的な料理を通して膵島のサイズの均一な分布を維持しようとすると、治療に対する反応を変更することができます。 実験群あたりの膵島の数は、実験のニーズに基づいて変更することができます。我々一膵島は約1000から2000のセルを持っていることを推定し、タンパク質とトータルRNAの25ngの0.3 -1μgのが得られます。 in vitroアッセイの場合、典型的な実験群は、メディアの1〜3ミリリットルで35mmまたは6センチメートル皿で100〜250小島メッキすることができます。移植のために、各レシピエントマウスは、実験計画（詳細は、ステップ5.2.2とディスカッションを参照）に応じて150〜400小島が必要になります。 手摘みのプロセスによって導入されるばらつきを最小限に抑えるために、我々は、膵島のサイズを推定するためのガイドとしてP200 -ピペット先端のオリフィスを使用してください。ほとんどの小島は、オリフィスの直径の約半分の直径を持って、私たちは一つの標準膵島としてのそれぞれをカウント。それよりも大きいか小さい任意の小島は、我々はそれに応じてさまざまな膵島数を割り当てます。我々は、20〜50のバッチで島を収集し、指定された実験的な料理に転送する。 P200 -ピペットを180マイクロリットルの容量で設定されている場合は、その人が先端に複数の島を（通常は50以上の島）収集することができます。このように、島が一つずつ選ばれているにもかかわらず、人はpipetmanのリリース機構を制御することにより、それぞれのP200チップ内に多くの膵島を収集することができます。これは、数百のピッキング、あるいはそれ以上の実験に必要な膵島の千以上を容易にします。我々はまた、同様の品質と大きさを持つ島の分布を均等に役立つこのバッチ式で操作を使用してください。 5。被膜下腎膵島移植移植のレシピエントマウスに糖尿病を誘発する。 4〜6時間の高速の上に置いてマウス。最適な移植レシピエントは10〜6の間の週齢になると、高速時の20〜25グラムを比較検討する必要があります。速くマウスに、feediから食べ物を削除するngのラックと常に新鮮なケージでマウスを置きます。これは以前に自分のケージに陥っていることが食品の残存ビットからマウスを分離することにより、真の高速を確保。糖尿病になることをマウスの80％〜90％のための計画。 高速に三時間、クエン酸ナトリウム緩衝液を準備する。酵素グレードのクエン酸ナトリウム0.735グラム（ナトリウムクエン酸、ミスター294.10グラム/モル）を秤量し、滅菌脱イオン水の25mlsでそれを溶かす。 HClを用いてpHを4.5に調整する。このバッファは、実験の各ラウンドのための新鮮なされるべきである。 1.5ミリリットルEppendorph遠心チューブに入れる0.05グラムストレプトゾトシン（STZ、M rは 265.2グラム/モル）。この金額は、約8匹のマウスに糖尿病を誘発するのに十分です。注入するマウスの数については1.5ミリリットルチューブの適切な数を準備します。 STZは敏感な光なので、アルミホイルで各チューブをカバーする。 高速の4時間後、新鮮なバッファーをクエン酸Naは行った1mlのとSTZの一つチューブを再懸濁します。一度再懸濁し、STZ – Naのクエン酸塩溶液は、15〜20分以内に活動を失いますので、この手順は、マウスを注入する前に直ちに実行する必要があります。 マウスを190mg/kgの最終的な投与量を達成するためにSTZ – Naのクエン酸溶液を適当量の各マウスの腹腔内に注入する。この用量は、マウスの系統や年齢によって異なる場合があるので、それは糖尿病の発症率が低すぎるまたは多すぎるマウス場合であれば投与量の最適化を実行する必要があります注射後3〜5日で死んでいる。一般的な用量は250mg/kg、マウスにマウスを150mg/kgの範囲を使用していました。 すべてのマウスが注入された後、食品や水を供給する。 非空腹時高血糖のための試験マウス（> 350mg/kg）注射後2〜4日。非空腹時高血糖の3日間連続を示すマウスは、移植のレシピエントとして使用することができます。 移植用膵島を準備 4.0までのステップ2.0で上記のような島を分離します。必要に応じて、膵島は移植のまたはの前日に単離することができる。 滅菌1.5ミリリットルEppendorphチューブにそれらを置くことによって、移植のためのグループに膵島を選択してください。チューブを氷中に保管してください。正常血糖を復元するために必要な膵島の数は、実験（膵島のドナー株、レシピエントの体重とひずみ、および受信者に与えられた追加の治療法）と小島を拾っている人の条件を与え異なる場合があります。レシピエントマウスのサイズが大きいマウスはより多くの膵島を必要とするので、最小限の膵島の数に影響を与える一つの主要な変数です。私たちは常に300島以上のC57BL / 6レシピエントマウスを20gramに18に根治ている間に150から250の島はわずかに正常血糖を復元することがわかります。これらの実験では、膵島ドナーマウスは、C57BL / 6または匹のBalb / Cのいずれかであった被膜下腎ポーチに移植膵島以下の材料を（すべての手術器具を滅菌する必要があります）に組み立てます。 表1。移植のための設備 25μlのハミルトンシリンジ PE 50フレキシブルチューブのカットので、片側が面取りさの6" ゲルローディングとP200のピペットチップ滅菌Eppendorphチューブ（受信者ごとに1） イソフルランおよびイソフルラン気化器 Eppendorph管ラックマクファーソン- Vannasはさみ（1） ベントアームの鉗子（2） 止血（1） クリップと創傷クリップ 27ゲージの針炎は*ガラス毛細管のプローブを引っ張ら綿は、アプリケーターをひっくり返した滅菌PBS 50mlのコニカルチューブ縫合電気はさみ 70％エタノールをスプレーボトルボールペン Betadine 透明なプラスチックの滅菌ドレープ *注意：これらのプローブを作製する場合、マウスの腎臓の角を模したプローブで円弧を作成しようとする。さらに、プローブの端が十分にないシャープなエッジが存在しないように研磨燃え上がるされていることを確認してください。 すべての糖尿病レシピエントマウスの重量を測定してタグ付け。各グループは同じように体重をマッチしたように、移植に先立って、実験群にそれぞれマウスを割り当てます。 イソフルラン気化器からのガス出口を備えたオープンフロントフード内で手術野を設定します。 イソフルランとレシピエントマウスを麻酔してから、電気はさみでその側面を削る。移植が行われる領域の外側でマウスを剃る。 それは剃毛側面が上を向くようにして、直接ガラス棒のシャフトを介して垂直に横たわって麻酔し、位置にマウスを返します。 70％エタノールでスプレーフランク。マウスは3回繰り返したbetadineとアルコールを交互の外科スクラブで整形処理されるためです。剃毛側面へのアクセスを許可する明確な滅菌ドレープでマウスを羽織る。 マウスに麻酔をされている間移植のために島を準備します。次の手順を完了することによってこれを行います。 先端の狭い方の端でU字を作る穏やかな曲がりがあるように1.5ミリリットルEppendorph管の開口部に無菌のゲルローディングチップを置きます。先端の開口部はEppendorph管のうち直接上向きにしてください。これは島と移植されている小島の数の減少が切断されるのでゲルローディングチップのどの時点でもキンクを導入しないでください。 ゆっくりと氷からのステップ5.2.2で調製した膵島のチューブを取り外します。膵島のすべては、チューブの底に解決されるべきである。 P200のピペットを使用して、静かにチューブの底から最小の音量で島を収集する。ステップ5.3.6.1で調製されたゲルローディングチップの大開口を介してこれらの島を転送します。島にはゲルローディングチップの狭い長さや幅の狭い制限に解決すべきだ。 島が沈降した後、できるだけゲルローディングチップからメディアをできるだけ多く削除します。これは、膵島ベアリングゲルローディングチップの大開口を介してメディアを吸引することでP200のピペットに添付された新鮮なゲルローディングチップを使用して行うことができます。 PE 50フレキシブルチューブ（長さは〜15cm）の中に沈殿した膵島を転送する。これは、まず、P200のピペットに先端を接続する前に膵島有利子ゲルローディングチップの狭い開口部にチューブの非面取り端を取り付けることによって行うことができます。小島は、チューブの長さの60％によってプッシュすることができます。 25μlのハミルトンシリンジに膵島ベアリングPE50チュービングを転送します。シリンジプランジャがチューブを転送する前に撤回されていることを確認します。注射器の針にPE50チュービングの非斜めのエッジを接続します。 小島は離れて傾斜した開口部から約0.5センチメートルになるまで注射器のプランジャーを押し下げ。 腎臓は、膵島を受信する準備されている間に島がチューブの斜めの開口部近くの一塊に落ち着く可能性があることを置いておくので注射器を設定します。 あなたの指を使用して、麻酔下のマウスの皮膚を通して腎臓をローカライズ。ボールペンの軸に直接腎臓があると脊髄に垂直に配置される領域の下でなければなりません。 腎臓がローカライズされると、脊髄に垂直な方向に直接上記の真皮を通じて2センチメートル切開を行うことマクファーソン- Vannasのはさみを使用してください。この切開は腹膜壁を公開します。 マクファーソン- Vannasのはさみは、真皮層を介して、カットと同じ方向で腹膜壁を通して1センチメートル切開を行うことで。それは、この切開によって作成された開口部が露出している腎臓よりも小さくなることが重要です。 バックストップとして、ガラス棒のシャフトを使用して、目を押し下げて、腹膜の開口部を通って腎臓を強制的に電子隣接面。開口部が腎臓よりもわずかに小さい場合、腎臓は、追加操作または接触することなく安定してマウスの表面の開口部と残り奪い合うだろう。このポジショニングは、その後の移植の手順に最適です。開口部が大きすぎる場合、腎臓はそれが難しいの後続のステップを完了すること、腹腔内にフォールバックします。 浸した綿を使用して氷冷滅菌PBSで露出腎臓の表面を湿らはアプリケーターをひっくり返した。この手順を数分おきに繰り返すかのような乾燥から腎臓被膜を防ぐために必要。 27ゲージの針を使用して、右側の側面に向かって左側の側面から移動する腎臓の前面全体の腎被膜を通して0.2センチメートル切開を行います。 炎を使用すると、腎臓被膜と腎臓の実質の間に袋を作成する、ガラス毛細管のプローブを引っ張った。ステップ5.3.12で行われた切開してプローブを挿入することによってこれを行うと腎臓の背側面に沿って前後方向に動かします。理想的なプローブは、腎臓のこの表面の自然な円弧と一致することで曲がりを持つことになります。これは、プローブが大きい前方開口部を開いて引き裂くことなく、腎臓の最も後端に到達することができます。できるだけ長く、狭いとこの袋を作ることが重要です。彼らは島がカプセルから脱出できるように短くて広いポーチが理想的ではありません。細長いポーチは、島が莢膜ポーチから損失を最小限に抑えて腎臓の後端に向かって堆積することができます。 ステップ5.3.6で調製した25μlのハミルトンシリンジを取得し、フレキシブルチューブの斜めに開口部の非常に端に島を移動する。 ステップ5.3.13で準備嚢下ポーチにフレキシブルチューブの斜めのエッジを挿入します。面取りされたエッジは、長辺が腎臓の実質と接触するように、上向きにしてください。カプセルの中で最も後端にチューブを移動します。 ゆっくりとシリンジのプランジャーを押し下げて嚢下パウチにPE 50チューブから膵島を転送する。小島として堆積する島のためのより多くの部屋を作るうちにゆっくり戻って柔軟なチューブを袋いっぱいに。すべての島がポーチにチューブから転送されていることを確認します。空気や余分な液体でポーチを埋めるしないでください。 袋からPE 50チューブを除去した後、炎が静かにポーチの近位端に膵島をパックするためにガラス毛細管のプローブを引っ張ってください。これは後方方向に前方に移動する腎臓の外表面に沿ってガラスプローブをスライドさせてください。きつくかもしれない破裂嚢下ポーチの後端として島をパックし、島を解放しないように、注意してください。このステップでは、腎臓が腹膜腔の内部に戻されるとポーチの前部の開口部からの膵島の損失を最小限に抑えることができます。 曲がった腕の鉗子は、PBSに浸した綿を使用して、腎臓のために作られた開口部に隣接する腹膜ライニングを持ち上げて使用すると、ゆっくりと腹腔内に戻って腎臓をプッシュするためにアプリケーターをひっくり返した。 真皮層に腹膜壁と創傷クリップに縫合糸を適用することにより、マウスを閉じます。 残りのマウスのために5.3.19を通じてケージを繰り返し行って5.3.4にマウスを返します。マウスが完全に麻酔から回復するまでマウスがケージの下に加熱パッドまたは保護された目を持つ加熱ランプ付き保温してください。動物は、水でacetominophine（に6 mg / mL）で提供されるべきである。 後で24時間非空腹時血糖値をチェックしてください。すべてのマウスは、操作後の日（POD）1で（血糖<200mg/dl）正常血糖にする必要があります。 6。代表的な結果 2つの主な手順は、このプロトコルで説明されています：（1）膵島分離および腎被膜下​​（2）膵島移植。膵島分離の手順では、膵島の収量は、通常、年齢やひずみに応じてマウス当たり100から150の島の間の範囲である。膵臓の外分泌細胞からそれらの分離に関して、これらの島の純度は、それぞれの準備の間で大きく異なることがあります。しかし、ステップ3.3.7で室温Histopaque1077とステップ3.3.17で0.1ミリメートルのナイロンフィルターを使用するには、通常、島の99％以上の純度を可能にする。この純度は、膵島の追加の手選前に実現しています。膵島単離後の代表的な画像は、図8Dに示されています。としてこれらの画像に見られるように、島は典型的に荒い周縁直後に分離している。しかし、文化の中で時間とともに、健康な小島は滑らかな境界線（図8D）を取得し、維持します。いくつかの小島で、中央の壊死領域は、開発するコア内の暗い領域として現われ。タイムラプスイメージング（補足ビデオ1）で撮影したとして、この壊死性センターは、多くの場合、膵島から追放される。残りの島は、中央に空洞（データは示さず）と、おそらく機能していませんが表示されます。従って、我々は手選の過程で暗い中心と島を除外する。重要なことは、我々は分離の手続きを（ステ​​ップ4.2）以下の低い温度のインキュベーションが劇的に時間をかけて文化の中で中心壊死を発症する膵島の数を減らすことができることがわかった。 膵島移植の手順では、2つのステップが重要です：糖尿病と腎臓のサブカプセルエリアに膵島の配信の化学的誘導。糖尿病の誘導のために、目標は、STZ -注射したマウスの90％以上で高血糖を達成することです。これらのマウスは、数週間のための移植なしで生き残っていくだろう。この目標を達成するためにSTZの最適な投与量は、マウスの系統や年齢によって異なり、実験によって決定されるべきである。私たちは、体重を20mg/kgのような小さな違いが大きな違いを生むことができることがわかった。このように、狭い間隔で滴定を行う必要がある。同種、同系自己免疫、自己免疫同種同系、：膵島移植のために、重要な考慮事項は、4つの免疫学的コンテキストを持つことができるモデルです。同系モデルでは、ドナー株は、レシピエント系統と同じです。このように、島は受信者から適応免疫応答を起動しません。これは、研究者は"、一次関数以外の"膵島機能不全と受信者が特定の免疫拒絶反応以外の原因により損失を指す用語をめぐる問題を調査することができます。主要な非機能は、早期の移植の段階でと血糖値を達成するために小島の多数（≥2膵臓/患者）の要件のための膵島失敗の主な理由であると考えられている。従って、それは、膵島移植のための重要な問題です。このモデルでは、完全に正常血糖を回復していないマージナル膵島質量を使用する必要がありますし、マウスは、通常、POD 1の間のPOD 7に、移植後の早い段階で血糖値を検査する必要があります。我々の経験では、膵島の限界質量は、通常、マウスのC57BL / 6系統を用いて20グラムの受信者ごとに150および250平均サイズの小島の間です。同系のモデルを使うと、1つは特定の変調は、移植後早期に膵島の治療効果に影響を与えるかどうかをテストするために遺伝的または薬理学的に改変膵島を使用することができます。 同種および自己免疫モデルでは、膵島移植は、宿主Tリンパ球、Bリンパ球、および他の免疫細胞を含む適応免疫によって特定の免疫攻撃にさらされている。適応免疫は遅延免疫応答である。アッセイするために、この応答には、効果的に主要な非機能の影響を最小限に抑えるために、移植後早期に正常血糖を復元島の飽和数を移植する必要があります。島がとして移植片拒絶反応に対する島のすべての変更の影響を決定するために正常血糖の損失によって示さ拒否される前に、一つは、時間の長さを監視することができます。我々の経験では、300m以上の島は、20グラムのマウスと15〜21日ごとに必要とされるドナーとC57BL / 6（H – 2 b）とをBalb / c（H – 2 d）を用いて同種移植のための拒絶反応の時間です。受信者。 図1総胆管の十二指腸開口部を場所。肝臓、膵臓、胆嚢から排出する内因性の消化酵素は十二指腸で腸管に入る前に総胆管を通過する。圧力が外部の流体を追加することによって、システムに適用されている場合は、ダクトを通る流れの方向が逆転することができます。これは、膵臓が一杯と膨張になることになります。 図2総胆管の十二指腸開口部をクランプ。リベラーゼと膵臓を埋めるために、それは総胆管の十二指腸開口部をブロックする必要があります。これが適切に達成されていない場合は、リベラーゼは、腸の代わりに膵臓を記入します。 図3。ダイアフラムに対して肝臓の再配置は、総胆管の近位領域の可視化が可能になります。それは、その近位端（2.3.1で説明されているV字型の合流点）付近で試行された場合、総胆管のカニュレーションは、最もうまく達成することができます。 図4。"フリーで総胆管をCannulating手'メソッド。十二指腸を介してクランプされて止血剤は、マウスの後端に向かって引っ張られる時に総胆管の合流点が見えるようになります。ダクトカニュレーションは、この合流点に27ゲージの針を置き、それを介して駆動することによって達成することができます。 図5。手法"鉗子アシスト"により、総胆管をCannulating。テキストで述べたように、時にはダクトを取り巻く筋膜組織は、カニューレを挿入することが困難になります。 （A）これらのケースでは、27ゲージの針で顔の層をクリアするのに便利です。 （B）ダクトは、明確に可視化し、曲げアームピンセットでサポートすることができます。 （C）バックストップとしてピンセットを使用し、27ゲージの針は、リベラーゼの配信のためのダクトに挿入することができます。 図6。膵臓の伸縮があっても、最適な針の配置を示します。ダクトと周囲の筋膜組織の半透明な性質を考えると、一部のインスタンスではそれは実際にはしていない時にダクトがカニューレを挿入しているように見える場合があります。これが発生すると針が膵臓のカプセルに浸透した場合、膵臓の十二指腸領域は、リベラーゼの配信時に拡大して開始されます。しかし、全体の膵臓が灌流されず、これは低膵島収量になります。この問題を回避するには、特に胃の前部に取り付けられた膵臓の領域に入る酵素の兆候を見ることによって膵臓のにも拡大を監視します。 図7。灌流膵臓を削除する。マウスから膵臓を削除するには、内臓との接触のいくつかのポイントを中断する必要があります。 （AB）腸から膵臓を区切ります。 （C）胃から膵臓を区切ります。 （D）腸から膵臓を区切ります。 （EF）腹腔内で残りの連絡先をカット。 図8。小島の代表画像。島の相対的な純度と品質は、単離手順の完了時に顕微鏡的に推定することができる。 （A）目標は、膵臓から膵島を浄化することですが、外分泌細胞および残骸が時折存在する。 （B）膵島分離のストレスは、膵島周囲からの細胞の膵島と脱落の暗い中心領域として現れる細胞死を誘導することができる。 （C）実験のための膵島を選択する際、混入外分泌細胞の検出を避けます。 （D）ランゲルハンス島は、文化の中で時間とともに外観に変更。膵島は、分離からの回復として、彼らは、滑らかな外周面を取得する。時折大きな島で暗い中央部が見えるようになります。これらの細胞は細胞死のための肯定的な染色。 後の分離膵島の補足ビデオ1。タイムラプス顕微鏡。この16hrタイムラプスビデオでは小島は最終的に排出される壊死センターの開発を見ることができます。してくださいビデオはこちらをクリック 。