العزلة ، والإثراء ، وصيانة الخلايا الجذعية نخاعي
概要
يصف هذا البروتوكول من العزلة ، والإثراء ، وصيانة الخلايا الجذعية ورم نخاعي المستمدة من الفئران الطافرة مع سونيك القنفذ مسار النشاط خارج الرحم.
Abstract
وقد اقترحت أورام المخ لامتلاك عدد قليل من السكان من الخلايا الجذعية التي هي السبب الجذري لتكون الأورام. وقد تم اعتماد المقايسات Neurosphere عموما لدراسة طبيعة الخلايا الجذعية العصبية ، بما في ذلك تلك المستمدة من الأنسجة الطبيعية ورمي. ومع ذلك ، وكميات ملموسة من التمايز وموت الخلية شائعة في neurospheres مثقف بسبب المرجح أن حالة شبه مثالية مثل إمكانية الوصول إلى جميع الخلايا ضمن المجاميع المجال لثقافة المتوسط.
يتميز نخاعي ، وأكثرها شيوعا ورم CNS الأطفال ، عن طريق التقدم السريع والميل الى الانتشار على طول محور الدماغ الشوكي كامل مع نتائج سريرية كئيبة. هو ورم نخاعي ظهاري من المخيخ ، وهو ما يمثل 20 ٪ و 40 ٪ من الورم داخل القحف والحفرة الخلفية في مرحلة الطفولة ، على التوالي 1. الآن أنها راسخة بأن SHH يحفز يشير انتشار الخلايا العصبية للدماغ السلائف الحبيبية (CGNPs) خلال التنمية مخيخي 2-4. وربطت دراسات عديدة باستخدام نماذج الماوس ، والذي يتم تنشيط المسار constitutively SHH ، مما يشير SHH مع نخاعي 5-9.
وأظهر تقرير صدر مؤخرا أن مجموعة فرعية من الخلايا المشتقة من الفئران نخاعي LacZ Patched1 / + هي الخلايا الجذعية السرطانية ، والتي هي قادرة على بدء والأورام propogating 10. نحن هنا وصف وسيلة فعالة لعزل ، وإثراء والحفاظ على الخلايا الجذعية المشتقة من ورم نماذج الماوس العديد من نخاعي ، مع تنشيط مسار SHH constitutively بسبب طفرة في مملس (11 ، على النحو المشار إليه hereon SmoM2) ، وهو النوع من الاختزال الذي هو أمر حاسم لSHH مسار التنشيط. في كل الأنسجة نخاعي معزولة ، كنا قادرين على إقامة العديد من المستعمرات التكاثري للغاية. يمكن لهذه الخلايا وأعرب بقوة عدة الخلايا الجذعية العصبية علامات مثل Nestin وSox2 ، مقاطع المسلسل الخضوع (أكبر من 20) وكان مولد الرمع. في حين أن هذه الخلايا الجذعية السرطانية مثقف كانت صغيرة نسبيا ، وغالبا ما bipoar النووية مع ارتفاع لنسبة حشوية عند المثقف في ظل ظروف لصالح وقف نمو الخلايا ، التي غيرت بشكل كبير على التشكل ، وسعت العمليات الخلوية متعددة ، بالارض ، وانسحب من دورة الخلية عند التحول إلى خلية مستنبت تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪. الأهم من ذلك ، هذه الخلايا الجذعية السرطانية المختلفة في Tuj1 + أو + NeuN الخلايا العصبية ، والخلايا النجمية GFAP + + CNPase oligodendrocytes ، وبالتالي تسليط الضوء على قوة متعددة. وعلاوة على ذلك ، كانت هذه الخلايا قادرة على التكاثر medulloblastomas الثانوية عند زرعها في الفئران orthotopically المضيف.
Protocol
Discussion
نحن تصف وسيلة فعالة لعزل ، وإثراء والحفاظ على الخلايا الجذعية من أنسجة الورم نخاعي الأولية التي تم استردادها من الفئران الطافرة مع إشارات نشطة constitutively القنفذ. وجدنا أن واحدة خطوة حاسمة في وضع بنجاح الجذعية السرطانية صحية خط الخلية هو العلاج Accutase المستخدمة أثناء تفك?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من فاندربيلت ، انجرام السرطان غرانت مركز الدعم (P30 CA068485) ، واستئصال ورم من الدماغ مؤسسة الطفولة والمعاهد الوطنية للصحة (NS042205).
Materials
| Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | ||
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X | |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X | |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% | |
| Gelatin | Sigma | G1393 | 0.1% | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030081 | 2mM | |
| Primaria dishes | Fisher | 087724C | ||
| Sox2 antibody | Millipore | MAB4343 | Mouse, 1:1000 | |
| Nestin antibody | DSHB | rat401 | Mouse, 1:200 | |
| YFP antibody | Molecular Probes | A11122 | Rabbit, 1:2000 | |
| GFAP antibody | Neuromics | CH22102 | Chicken, 1:1000 | |
| Tuj1 antibody | Sigma | T5076 | Mouse, 1:2000 | |
| NeuN antibody | Millipore | MAB377 | Mouse, 1:2000 | |
| CNPase antibody | Millipore | MAB326 | Mouse, 1:1000 |
参考文献
- Rossi, A., Caracciolo, V., Russo, G. Medulloblastoma: From Molecular Pathology to Therapy. Clin Cancer Res. 14 (4), 971-971 (2008).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. Control of Neuronal Precursor Proliferation in the Cerebellum by Sonic Hedgehog. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).
- Dahmane, N., Ruiz, A., Altaba, I. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3089 (1999).
- Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Curr Biol. 9 (8), 445-445 (1999).
- Fan, X., Eberhart, C. G. Medullablastoma Stem Cells. J Clin Oncol. 26 (17), 2821-2821 (2008).
- Yoon, J. W., Gilbertson, R., Iannaccone, S. Defining a Role for Hedgehog Pathway Activation in Desmoplastic Medulloblastoma by Identifying GLI1 Target Genes. International journal of cancer. 124 (1), 109-109 (2009).
- O’Dorisio, M. S., Khanna, G., Bushnell, D. Combining anatomic and molecularly targeted imaging in the diagnosis and surveillance of embryonal tumors of the nervous and endocrine systems in children. Review. Cancer metastasis reviews. 27 (4), 665-665 (2008).
- Corcoran, R. B., Bachar Raveh, T., Barakat, M. T. Insulin-like Growth Factor 2 Is Required for Progression to Advanced Medulloblastoma in patched1 Heterozygous Mice. Cancer research. 68 (21), 8788-8788 (2008).
- Gilbertson, R. J., Ellison, D. W. The Origins of Medulloblastoma Subtypes. Annual review of pathology. 3, 341-341 (2008).
- Ward, R. J., Lee, L., Graham, K. Multipotent CD15+ Cancer Stem Cells in Patched-1 Deficient Mouse Medulloblastoma. Cancer research. 69 (11), 4682-4682 (2009).
- Mao, J., Ligon, K. L., Rakhlin, E. Y. A Novel Somatic Mouse Model to Survey Tumorigenic Potential Applied to the Hedgehog Pathway. Cancer research. 66, 10171-10171 (2006).
- Han, Y. G., Kim, H. J., Dlugosz, A. A. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature medicine. 15 (9), 1062-1062 (2009).
