Visualisation cellule à cellule de transfert du VIH en utilisant des clones fluorescents du VIH et Live microscopie confocale

Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans Hübner et al Sciences 323:. 1743-1747 (2009) . 1. Aperçu De cellule à cellule propagation du VIH a été initialement décrite en utilisant des cellules Jurkat infectées au VIH que les cellules du donneur et de cellules CD4 + primaires lymphocytes T comme les cellules d'accepteur 1,2,3. Dans ces études, le virus a été détecté dans les cellules fixes utilisant une coloration d'anticorps. Pour suivre le transfert de virus de cellule à cellule dans les cellules vivantes, nous exploitons un recombinant, clone moléculaire infectieux du VIH appelé VIH Gag-iGFP 4. Il porte la protéine fluorescente verte (GFP) inséré en interne en la protéine Gag entre les domaines MA et CA. Ce clone moléculaire infectieux du VIH conserve sans la nécessité d'un virus assistant. Les particules virales à partir de ce clone sont stoechiométriquement chargé avec la protéine fluorescente verte, fournissant un signal fort de fluorescence pour surveiller l'assemblage viral et de transfert entre cellules. Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec la cellule de suivi des inertes colorants fluorescents, les cellules réceptrices peuvent être discriminés à partir des cellules du donneur d'entrée, et permettant de visualiser le transfert du VIH d'une cellule T infectée à une cellule T non infectées 5. La formation des synapses virologiques et le transfert de virus d'une cellule à l'autre peut alors être observé dans les cellules vivantes alors qu'elles sont cultivées dans un récipient hermétique, perméable aux gaz de chambre d'imagerie. (Jour 1) 2. Préparation du VIH Gag-iGFP transfectées cellules Jurkat T Préparer le CD4 + humains T lignée cellulaire Jurkat (ATCC, Manassas, VA) en prenant soin de maintenir les cellules à une concentration comprise entre 2 x 10 5 et 8 x 10 5 cellules / ml dans Jurkat milieux de culture (RPMI 1640, 10% de sérum de veau fœtal, 100 unités / ml de pénicilline et 100 pg / mL de streptomycine). La clé du succès: la culture des cellules Jurkat à des concentrations supérieures à 8 x 10 5 cellules / mL se traduira par une réduction de l'efficacité de la transfection. Note: La transfection du VIH Gag-iGFP ADN proviral dans les cellules T, comme décrit ci-dessous, les résultats dans la production d'une compétents pour la réplication du virus de l'immunodéficience humaine. En tant que tel, toutes les procédures doivent être entrepris que par le personnel de laboratoire formé de certification du niveau de biosécurité 2 + ou du niveau de biosécurité 3 (BL2 + / BL3) chambres de culture de tissus. Travailler avec infectieuses VIH dans les établissements d'imagerie doit être approuvé par le bureau de biosécurité institutionnel local. Transfecter les Jurkats avec le plasmide virale, le VIH-Gag iGFP en utilisant la méthode nucléofection Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 cellules par centrifugation pendant 10 min à 150 x g. Aspirer le surnageant et laver les cellules dans une solution saline tamponnée phosphate stérile (PBS). Centrifuger les cellules et resuspendre le culot à 97 ul de pré-chauffé, V solution contenant Nucleofector compléter le fabricant. Ajoutez trois uL d'endotoxine libre VIH Gag-iGFP plasmide (1 ug / uL) à la suspension cellulaire et mélanger doucement. Transférer la suspension cellulaire à une cuvette et nucleofect utilisant le programme S-18. Immédiatement transférer les cellules à 3 mL de milieu de culture préchauffé Jurkat sans antibiotiques. Pour préparer les cellules CD4 + cibles pour les synapses virologiques, on obtient des cellules mononucléées du sang périphérique de buffy coats en utilisant un standard Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suède) du protocole. Lymphocytes T CD4 + sont ensuite sélectionnés négativement utilisant un kit d'isolation par billes magnétiques (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Elles peuvent être stockées cryogéniquement dans N2 liquide dans des aliquotes de 5 x 10 6 cells/500 ul de milieux de congélation (90% de veau fœtal serum/10% de DMSO). Décongelé CD4 + primaires des cellules T sont cultivées dans du RPMI 10% SVF, supplémenté avec 10 unités / ml d'IL-2. (Jour 2) 3. Récupération à partir de cellules vivantes avec le VIH Jurkats transfectées Gag-iGFP et la coloration des cellules cibles avec des colorants fluorescents Laisser les cellules Jurkat à se remettre de la transfection nuit. Puis éliminer les débris cellulaires par centrifugation sur un matériau hypaque ficoll gradient de densité. Distribuer 1,5 ml de Ficoll-Paque au fond d'un tube de 15 ml conique. Doucement superposition ce matériel dégradé avec l'Jurkats transfectées dans un volume de 5 mL de RPMI. Centrifuger les cellules à 400 xg pendant 20 min à température ambiante avec le frein off. Retirez délicatement les cellules de l'interface médias / Ficoll à l'aide d'une pipette. Les transférer à un nouveau 15 ml tube conique. Diluer les cellules avec IPMB à un volume total de 15 ml et centrifuger à 300 xg pendant 10 min. Reprendre le culot dans 3 mL de milieu de culture dans un Jurkat 2 cm et (6-même plaque) et le retour des cellules à l'incubateur de culture tissulaire. Afin de distinguer les cellules cibles à partir des cellules du donneur dans les expériences de transfert de cellule à cellule, nous prelabel les cellules CD4 + cibles avec des colorants fluorescents. CD4 + primaires des cellules T sont étiquetés de la mêmeING avant utilisation. Nous avons eu d'excellentes cellules T étiquetage succès avec les deux CellTracker et colorants CellTrace (Invitrogen, Carlsbad, CA). Alors que la concentration de colorant et les temps d'incubation doit être optimisée en fonction du colorant particulier et le type cellulaire utilisé, un protocole représentatives suit. Pellet 4 x 10 6 cellules CD4 + primaires T par rotation à 400 xg pendant 10 min. Laver les cellules avec 5 ml de PBS et de remettre en suspension dans 2 mL de PBS. Ajouter CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) à une concentration finale de 1,5 uM et incuber à 37 ° C pendant 20 min. Ajouter 8 ml de milieu complet et Jurkat centrifuger à 400 xg pendant 10 min. Resuspendre les cellules dans 3 mL de milieu complet supplémenté avec 10 unités / ml d'IL-2 et le placer dans l'incubateur de culture tissulaire pendant la nuit. (Jour 3) 4. Surveillance de cellule à cellule de transfert du VIH Gag-iGFP utilisant imagerie de cellules vivantes Nous utilisons régulièrement le VIH Gag-iGFP cellules Jurkat transfectées 48 heures post-transfection. Cependant, nous avons utilisé avec succès des cellules dès 24 heures, et au plus tard 72 heures après transfection. Environ 48 heures après la transfection, le VIH-Gag iGFP Jurkats exprimer sont comptés, lavés avec du CO 2-médias indépendants (Invitrogen, Carlsbad, CA), et remis en suspension dans l'imagerie cellulaire direct des médias (CO 2 médias indépendants, 10% de sérum fœtal bovin, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / mL de streptomycine, 10 unités / ml d'IL-2) à une concentration de 1-3 x 10 7 cellules / ml. De façon similaire, les laver et resuspendre étiquetés CD4 + primaires des cellules T à une concentration de 1-3 x 10 7 cellules / ml en direct des médias d'imagerie cellulaire. Mélanger le VIH Gag-iGFP transfectées avec Jurkats CD4 + primaires des cellules T à un ratio de 1:2 ou 1:3 et de la charge dans une culture tissulaire traitée, perméables au gaz, microchambre (ibidi, Vérone, WI). Par exemple, mélanger de 20 uL du VIH Gag-iGFP Jurkats transfectées avec 40 ul de étiquetés CD4 + primaires des cellules T. Charge 50 ul de ce mélange dans une chambre ibidi et sceller la chambre avec des bouchons. Fixez les bouchons en enveloppant le bouchon / interface de chambre ibidi avec du parafilm. 5. Considérations pour les plates-formes de microscopie: disque rotatif imagerie confocale Après le chargement d'une chambre d'imagerie ibidi avec les cellules, nous avons immédiatement monter l'appareil sur un microscope optique inversé (iX71 Olympus, Center Valley, Pennsylvanie). La chambre ibidi devrait être transféré à la loupe seulement par le personnel de laboratoire BL2 + formés portant des vêtements de sécurité appropriés. Bien imagerie des cellules vivantes utilise couramment chambres d'incubation coûteux à maintenir une stabilité à 37 ° C l'environnement, ceci a été réalisé en utilisant un appareil de chauffage simple et économique thermostatique (ASI 400, Nevtek, Williamsville, Virginie) avec une pointe de T-type de thermocouple monté à côté l'échantillon de rétroaction bonne température. Nous avons trouvé à l'aide de CO 2-média indépendant nous permet de maintenir la viabilité des cellules de haute tout en évitant l'utilisation d'une chambre de CO 2. Afin d'atténuer les fluctuations de température plateforme contre dans la chambre et pour bloquer la lumière ambiante de fond, un grand linceul noir est drapée sur l'ensemble microscope / chauffe-setup créer une poche d'air isolant autour du système. Ceci réduit considérablement les variations de température et de la dérive de l'échantillon associée liés à la température, mais nécessite de pré-chauffage pendant 30 minutes avant le montage de l'échantillon. 6. Acquisition de données, de transfert et de traitement d'image Les images sont prises avec un objectif 60x 1,42 NA immersion dans l'huile (UPlanApo N, Olympus) que l'ouverture numérique élevée (NA), améliore considérablement la résolution. Pour créer des images 3D confocale, la numérisation est effectuée par une unité de disque rotatif confocale (CSU-10, Yokagawa, Japon) qui utilise simultanément> 800 places confocale à augmenter considérablement la vitesse de balayage. Pour compléter sa vitesse, la CSU-10 est couplé à une très sensible électrons multipliant dispositif à couplage de charge (EMCCD, ixon + 897, Technologies Andor, Irlande) pour permettre à la caméra rapide, l'imagerie de faible luminosité qui diminue à la fois photoblanchiment et de phototoxicité. La source de lumière de fluorescence est un multi-longueur d'onde ARKR ions de gaz laser (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), où la longueur d'onde désirée (488 nm) et la puissance du laser mesurée juste avant l'objectif du microscope (<1 mW) sont sélectionnés par un modulateur acousto- optiques filtre accordable (AOTF), (Technologies Andor). Afin de réduire davantage photoblanchiment et d'étendre l'imagerie en temps total, le AOTF rapidement (microsecondes) coupe le faisceau laser à chaque fois que l'appareil est inactif (10-20 ms) tandis que l'image nouvellement acquises est délivrée par le CCD (15-30 ms d'exposition) à l'ordinateur. La lumière laser est couplé au système de disque rotatif utilisant une 405/488/568/647 quadribande miroir dichroïque (Semrock, Rochester, NY). Émission de fluorescence est filtré en utilisant un filtre passe-bande 525 / 50 (Semrock) à l'intérieur une roue à filtres (Ludl Electronic Products, Hawthorne, NY) monté bntre la caméra EMCCD et l'unité de disque confocale filer. Tout le matériel et l'acquisition, y compris un z-scène (Mad Labs ville, Madison, WI), sont contrôlés par le Andor iQ v1.8 logiciel. Afin de maximiser la vitesse d'acquisition à environ 01/02 à 01/09 secondes piles d'images 3D, nous recadrer la zone d'enregistrement de caméra de l'EMCCD jusqu'au voisinage immédiat de la cellule-paire. Par ailleurs, au détriment de certaines informations en z, un grand z-étape entre 0.45 à 0,75 um peut être utilisé pour accélérer l'acquisition. Imagerie dans ces conditions, peut durer jusqu'à 6 heures – en utilisant en continu de 20 à 60 segments minute – avec photoblanchiment minime. Au total, chaque segment de données occupe généralement 50 à 20 Go d'espace alors que des dizaines de milliers d'images sont prises. Pour faciliter le transport et l'analyse des fichiers de données volumineux, chaque ensemble d'acquisition doit être décomposé et exportés comme une segments TIFF Gb fichier image en utilisant l'Andor iQ v1.8 logiciel. A partir de là, de nombreux logiciels sont disponibles pour une excellente analyse de l'image, comme Metamorph, Volocity et ImageJ (nous vous recommandons de ses îles Fidji variation). Lorsque deux marqueurs fluorescents doivent être suivis, nous enregistrer simultanément deux d'entre eux, sans ralentir l'acquisition en utilisant un "mode écran partagé." Les deux marqueurs sont excités par deux lignes laser ARKR à la fois (souvent 488 et 568 nm). Inséré directement devant la caméra EMCCD est une image (OptoSplit II, Cairn, Kent, UK) séparateur qui sépare les deux images différentes. Chaque image est ensuite filtrée de manière indépendante en utilisant des filtres de fluorescence (Semrock) et projetée côte-à-côte sur la caméra à la fois la création du "split-screen" en vigueur. Ce serait alors besoin de culture manuelle et l'alignement des images plus tard dans le traitement d'image. 7. Considérations de traitement d'image et analyse de données Nous généralement effectuer une analyse d'image avec Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) sur les ordinateurs Macintosh (Apple, Inc.) Filature des images de disque laser, microscopie confocale sont d'abord ajustées dans leur intensité pour corriger photoblanchiment, puis déconvoluées avec Volocity. Mesures de l'intensité et le suivi des points lacrymaux Gag est effectué avec le module de quantification Volocity. Pour les ensembles de l'image où le mouvement par rapport à une synapse pré-formé doit être calculé, un algorithme de suivi automatisé est employé qui suit le bouton synaptique à travers la séquence entière. L'inspection manuelle des régions d'intérêt défini par le logiciel Alignement automatique doit être effectuée pour confirmer que le logiciel a correctement suivi l'objet désiré. Pour les objets, où le contraste avec les objets environnants est trop faible, le suivi manuel ne peut être effectuée sur une base trame par trame. Le progiciel permet Volocity l'exportation de l'emplacement XYZ, le volume et le signal intégré dans les objets désirés. La distance entre la synapse et la vitesse de l'objet suivi sont calculées en normalisant les mouvements vers le centre du bouton synaptique. 8. Les résultats représentatifs Dans les 10 à 15 minutes de mélange ne doit être en mesure de visualiser le VIH Gag-iGFP cellules Jurkat exprimant adhérant aux cellules CD4 + primaires T. Imagerie ces conjugués, on peut évaluer les mouvements des points lacrymaux Gag dans les cellules infectées ainsi que dans les cellules cibles après synaspe. On peut observer le mouvement des Gag-iGFP lacrymaux dans les cellules cibles, peu après les synapses se forment.