Görselleştirme ve Miktar hücre içi Etkileşimleri Neisseria meningitidis ve İnsan

1. İmmünofloresan Protokolü Tohumculuk, Enfeksiyon ve immüno-boyama Aşağıdaki yordamlar, uygun güvenlik düzeyi doku kültürü ve mikrobiyolojik laboratuvar olanakları gerektirir. 1. GÜN A. enfeksiyon için hedef hücreler hazırlanması Tohum HBMECs cam lamelleri% 50 izdiham (~ 1.5×10 4 hücre / cm 2) (16 mm çapında), 12 plaka (iyi 3,8 cm 2 büyüme alanı /) içine yerleştirilir . Büyüme orta: RPMI 1640% 15 ısı ile inaktive edilmiş (56 ° C, 30dk) FBS, 2 mM glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U / ml penisilin / streptomisin,% 1 (v / v) MEM elzem olmayan bir amino ile desteklenmiş asitler çözüm ve% 1 MEM vitaminleri çözüm. 37 ° C gecelik (O / N) üzerinde Kültür,% 5 CO2 inkübatör. B. Bakteriyel kültürü 37% 10 ısıtılmış at kanı ile takviye gerekli orta örneğin Beyin Kalp İnfüzyon (BHI) agar plaklarına faiz yükü büyümeye O / N% 5 CO 2 atmosfer 4 ° C (16-18 saat). 2. GÜN A. Of Bakteriyel (N. meningitidis) Süspansiyon hazırlanması 10 mcL kültür döngüsü kullanarak, 2 mL PBSB (kalsiyum ve magnezyum ile PBS) gecelik bakteri kültürünün bir süspansiyon olun. Büyük bakteriyel büyüklükler oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca stand süspansiyon bırakarak yerleşmek için izin verin. Pelet bozmadan, steril bir tüpe süspansiyon üst 1 ml (hisse senedi inokulum) aktarın. Stok inokulum bakteri sayıları tahmin etmek için, 1 ml hacimli 0.1M NaOH% 1 SDS içeren tüplere alikotları (20-50 mcL) ekleyin ve hafifçe karıştırın çözünebilmesi. 260nm (A260) absorbans belirleyerek çözüm nükleik asit içeriği ölçün. Bizim ellerde, 1 tekabül A260 5×10 8 koloni birimleri şekillendirme / ml (kob / ml). Bu PBSB stok inokulum dilüsyonları bir dizi hazırlamak agar plakaları üzerinde kaplama ve O / N inkübasyondan sonra koloniler sayma kontrol edilebilir. Enfeksiyon orta stok inokulum bir kısım sulandırınız [decomplemented (% 2 ile desteklenmiş M199 (56 ° C, 30dk) normal insan serumu (NHS)], hedef hücreleri enfeksiyon için gerekli olan bakteri yoğunluğu elde etmek için. Laboratuvarımızda, hedef hücre başına 200-300 bakteri enfeksiyon oranı rutin kullanılır. B. Hücre Kültürü Enfeksiyonu Kültürlü hedef hücreleri 3 kez antibiyotiklerin herhangi bir iz kaldırmak için Hank orta lamelleri yıkayın. % 5 CO 2, 3 saat 8 saat 37 taze hazırlanmış bakteri süspansiyonları (yukarıda açıklandığı gibi) ° C ile hücreleri enfekte. Enfeksiyon döneminin sonunda, 4, 30-45 dakika süreyle RT veya O / N% 2 paraformaldehid 500 mcL (PFA) hücreleri PBS ile üç defa yıkamak ve düzeltmek ° C Yukarıda gösterilen konsantrasyon ve saatte Paraformaldehit fiksasyon, bakteriyel ve hücresel morfoloji korunması için uygun olduğu tespit edilmiştir. Paraformaldehid kapalı yıkadıktan sonra,% 0.1 Triton X-100 10 dakika süreyle PBS içinde seyreltilmesi kuluçka tarafından paraformaldehid sabit hücreler permeabilise. Örnekleri PBS ile 3 kez yıkayın. Immüno-boyama geçin veya alternatif olarak, 4,% 1 BSA / PBST O / N 500 mcL örnekleri terk ° C 3. GÜN Immüno-boyama Hücre içi bakteri boyama ve aşağıdaki gibi α-aktinin uygun birincil ve ikincil antikor kullanımı ile sırayla veya aynı anda yapılabilir; tüm işlemleri 12 kuyucuğu yapılabilir. Blok 500 mcL% 3 ile permeabilised hücreleri içeren lamelleri RT 30-60 dakika BSA / PBST (PBS Triton X-100% 0.05 içeren) PBS ile yıkadıktan sonra, 12 plaka her lamel yeni bir kuru, iyi transfer. Bakteri ve α-aktinin karşı primer antikor ekleyin; lamel yüzeyini kapsayacak şekilde dikkatlice ilave seksen 100 mcL lamel ortalama antikor yeterli olacaktır. 1s için oda sıcaklığında inkübe edin. Biz aynı anda α-aktinin (Abcam) karşı Neisseria meningitidis (laboratuar kaldırılan) ve fare monoklonal antikor (mAb) karşı tavşan poliklonal antiserum kullanılır. Bazı deneylerde, anti-α-aktinin yerine, aktin ve vimentin karşı mAb (Sigma) kullanıldı. Inkübasyon sonunda, iyi PBS 200 mcL eklemek için yeni bir de içeren 500 mcL PBS lamel ve yer kaldırın. 5 dakika sonra, pipetleme tarafından PBS çıkarın ve sonra taze PBS ekleyin. Iki kez tekrarlayın. Lamelleri bir aktarınyeni kuru kuyu. Karanlıkta 1s için oda sıcaklığında inkübe;% 1 BSA / PBST seyreltilmiş farklı fluorochromes konjuge uygun sekonder antikor ekleyin. Bakteriyel tespiti için, biz TRITC ile konjuge anti-tavşan Ig kullanılan ve α-aktinin ve diğer iskelet protein tespiti için, konjuge anti-fare Ig kullanılan ya FITC (Sigma) veya Alexa Fluor 488 – (Invitrogen). Inkübasyon sonunda, 4 ve 5. adımları olarak yıkayın. Sayaç karanlık RT az 5 dakika için 0.6 mg / ml PBS içinde DAPI (DNA leke) ile leke. PBS ile durulayın. Montaj orta bir damla slaytlar (e, g. Mowiol veya Vectashield) Mount lamelleri (hücreleri aşağı bakacak şekilde) 4 ° C karanlıkta saklayın Örnekler mikroskop altında gözlem için hazır. 2. Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM) Gözlemlemek ve hücre içi bakteri ve iskelet elemanları görüntülerini yakalamak için, Leica DM I6000 ters Epifloresans mikroskop bağlı bir Leica SP5-Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak immunolabelled örnekleri ve çekilen görüntülerin kullandı. Tüm görüntüleri Leica yazılımı ile 63x NA 1.4 yağ daldırma amaç ve süreci kullanılarak toplanmıştır. CLSM prosedürü: CLSM prosedürü başlatmak için, objektif bir damla immersiyon yağı ekleyin ve mikroskop aşamasında örnek slayt, lamel-yüzü aşağı yerleştirin. Mikroskop görsel moduna ayarlayın ve mikroskop göz parçaları kullanılarak ilgi alanı bulmak. Leica Yazılım kullanarak, xyz satın alma modunu seçin. 512 x 512 formatında (kare boyutu) seçin. Colocalisation çalışmalar için, yüksek çözünürlük, daha doğru görüntü; mikroskop çözünürlük sınırı göz önünde tutmak. Daha sonra çift yönlü X modunda, tarama hızı artacak seçin ve fotoğraf beyazlatma azaltmaya yardımcı olur. Sıralı tarama ayarlarını ayarlayın. "Sıra" fonksiyonu tıklayın ve tarama modlarından birini seçin. Biz modu "satırları arasındaki" kullanabilirsiniz. DAPI (mavi), Alexa Fluor TRITC için 488 (yeşil) ve 561 nm (kırmızı) için 488 nm 405 nm: Seçiniz lazer sekonder antikor konjuge fluorochromes göre kirişler. Photomultiplier Tube (PMT) sırasıyla 1, 2, ve 3 etkinleştirin. Doğru emisyon dalga boyu algılamak için PMT ayarlarını yapın. Z yığınları veya seri ("başlamak") üst ve alt ("son") ayarlayın. Sonra, gerekli "z adım boyutu" olarak ayarlayın. Neisseria meningitidis bir Diplococcus (Şekil 1G) ve her coccus yaklaşık çapı 0.5 mm yana, 0.20 mm z-adım boyutu en az iki kez her coccus tarama olasılığını artırmak için seçildi. 0.2 mm – 0.1 optimum çözümü için adım boyutu içinde de. Sinyal gürültü oranı artırmak için 3 hat ortalama seçerek son tarama parametrelerini ayarlayın. "Start" tuşuna tıklayarak, çift ya da üçlü lekeli görüntüler farklı dalga boylarında farklı kromoforlar arasında çapraz tartışma ortadan kaldırmak için sıralı tarama elde edilir. Iki fluorochromes colocalisation bir göstergesi için seçilen kanallar tek bir görüntü birleştirme "overlay" fonksiyonu seçin, örneğin, Alexa 488 (yeşil) ve (kırmızı) TRITC fluorochromes hem colocalise zaman, sarı renk kaplanan görüntü görünecektir . Z yığınları veya seri mümkün colocalisation görselleştirmek için gerekli bir 2B görüntü yapımı için "maksimum projeksiyon" fonksiyonunu kullanarak derleyin. Colocalisation daha detaylı analiz, her optik bölümün analizi ile elde edilebilir. Z yığınları veya seri aldıktan sonra, çeşitli unsurları içi lokalizasyonu (Şekil 1E) görselleştirilmesi için dik bir görüntü elde etmek için verileri işlemek. 3. Colocalisation, ölçümü İstatistiksel analizler konfokal tarama mikroskobu görüntüleri Volocity yazılım (Doğaçlama, Perkin Elmer) ile yapılmaktadır. Bu yazılım Manders ve ark (1993) 5 açıklandığı gibi colocalisation analiz için özel olarak tasarlanmış bir araç sağlar. Colocalisation dijital floresan görüntüleme bağlamında her kanalda aynı voksel (piksel hacmi) yerde bir sinyal tespiti olarak tarif edilebilir. Iki kanal aynı örnek alan (Volocity kullanım kılavuzu) alınan iki farklı fluorochromes görüntüler oluşur. İstatistiksel analizler aşağıda açıklanan Kantitatif Colocalisation Analizi Volocity yazılım kullanarak (Doğaçlama, Perkin Elmer) ile yapılmaktadır. Kantitatif Colocalisation Analizi Volocity yazılımı kullanarak CLSM görüntüleri ile bir kütüphane oluşturun. Üst çubuktaki görüntü "genişletilmiş odak" ı seçin. Bu araç, analiz edilmesi gereken bir 2B görüntü z yığınları derlemek. "Ko" aracını seçin. Analiz edilmesi için iki kanal aynı renk derinliğine sahip olmalıdır. Sayısallaştırılmış olacak bu bölgeyi seçin. Herhangi bir arka plan çıkarmak için eşik değerlerini ayarlayın. "Ko oluşturmak" seçerek colocalisation çıktı oluşturun. Colocalisation istatistikler, daha önce seçilen ilgi bölgeler için oluşturulur. Seç Manders 'katsayıları R (üst üste katsayısı) ve (colocalisation katsayısı). Manders 'katsayıları toplam piksel yoğunluğu karşı normalize olarak boyanma yoğunluğu duyarlı değildir; böylece bir antijen boyama diğerinden daha güçlüdür istihdam edilebilir. Manders 5,6 katsayısı R bindirme gerçek colocalisation derecesi temsil eder, yani piksel piksel sayısı ile karşılaştırıldığında colocalise sayısı. Öte yandan, colocalisation katsayısı, Benim, daha bol benzer parçaları (bu durumda bakterilerin, kırmızı) daha bol benzer parçaları (bu durumda α-aktinin, yeşil) floresan katkı açıklar, yani kırmızı piksel sayısı kırmızı piksel sayısı ile karşılaştırıldığında, yeşil piksel ile örtüşüyor. Manders 'katsayıları, 1, 0 hiçbiri yüksek colocalisation olan, 1 ve 0 arasında değişir, ancak daha kolay yorumlanması için yüzdesi olarak ifade edilebilir. Veri sunumu için bir Excel belgesi ihracat istatistikleri değerleri. 4. Temsilcisi Sonuçlar Hücre içi yerelleştirme Opc ifade Neisseria meningitidis ve α-aktinin Α-aktinin (gösterilmemiştir), 3 ve 8 saat, 3 saat enfeksiyon deneylerde daha az olduğu ortaya çıktı Nm belirtilen colocalisation yukarıda açıklandığı için Nm ile enfekte insan beyninin mikrovasküler endotel hücreleri Konfokal görüntüleme, 8 saat boyunca enfekte kültürleri ile karşılaştırıldığında ( Şekil 1 AF). Opc ifade Meningokoklar α-aktinin kanıtlanabilir colocalisation> 5 çoğaltmak deneylerde her zaman gözlendi. Yukarıda açıklandığı gibi birkaç konfokal görüntüleri kullanarak colocalisation istatistiksel analizi gerçekleştirildi. Genel olarak, HBMEC ile enfekte Opc-ifade Meningokoklar, yeşil (α-aktinin) ve kırmızı (Nm) piksel>% 25 örtüşme (Şekil 2B, katsayısı R Overlap) elde edildi. Vimentin nadir içselleştirilmiş bakteri ve ya aktin ve vimentin etiketlenmesi yapıldı α-aktinin, deney aksine, zaman zaman colocalisation aktin ama gözlenmiştir (Figure. 2B). Bu veriler de her kısmın göreceli bolluk dikkate alır katsayısı My kullanılarak analiz edildi. Daha bol sinyali (bu durumda yeşil, α-aktinin) daha az bol sinyali (kırmızı, bakteri bu durumda) ortaya her zaman ortaya çıkma sıklığı bir ölçüsüdür. Bu önlem, içselleştirilmiş Meningokok (Şekil 2A ve C) çevresinde α-aktinin, ortaya çarpıcı bir seviyesini gösterir. Şekil 1. N. içi etkileşimleri değerlendirmek için Konfokal lazer tarama mikroskopisi α-aktinin ile meningitidis. AH. Lamelleri yetişen konfluent endotel mono tabakaları Opc-ifade (AF) N. ile enfekte olmuş meningitidis. 8 saat sonra, yapışık olmayan bakteriler yıkandı, hücreleri paraformaldehid ile sabit ve% 0.1 Triton X-100 ile permeabilised. Daha sonra, yukarıda açıklandığı gibi bakteri ve α-aktinin (bakteri, kırmızı α-aktinin, yeşil) boyandı. AC. Nm (A) veya α-aktinin (B) yerini xy resimlerini gösteren bir alan. (C) Bindirme görüntüsünün sarı-turuncu renkli colocalisation düşündüren göründüğü çeşitli bölgelerinde gösterir. Oklar (A) ve (B) α-aktinin birikimi yüksek derecede bakterilerin çevresinde meydana gelmiş görünüyor bölgelerde gösterir. D., bir hücrenin üssünde bulunan, hücre içi bakteri çevresinde virüslü bir HBMEC tek tabaka belirten colocalisation Optik diseksiyonu. Yine, bu bölgede genel α-aktinin leke olarak bu colocalisation düşük, α-aktinin yanlışlıkla yakınlığı nedeniyle değildir. E ve F Üç boyutlu görüntüleri, yukarıdaki gibi işlenmiş enfekte HBMEC mono tabakaları. Apikal yüzey (E) oblik bir görünüm yapışkan bakteri gösterir lekeli kırmızı (kırmızı ok) endotel hücreleri (sarı ok) bazal yüzeyler doğru bulunan birkaç bakteri belirgin turuncu / sarı renkli ise. (F) bir son on XZ kesit. Bazal konumu daha net bir şekilde görülebilir. G. N. olumsuz lekeli bir elektron mikroskobu görüntü onun gösteren meningitidisgelen baskın diplococcal. Her coccus çapı yaklaşık 0,5 mikron. Şekil 2. HBMEC hücrelerin yerleri ve α-aktinin, aktin ve vimentin dağıtım. A. HBMEC, Etkilenmiş mono tabakaları efsanesi yukarıda açıklanan ancak α-aktinin için ek olarak, bazı lamelleri α-aktinin için benzer bir prosedür aktin ve vimentin tespiti için kullanılan tedavi edildi. Yukarıdaki gibi, α-aktinin birkaç içselleştirilmiş bakteriler (beyaz oklar) etrafında yoğunlaştı. Vimentin ve aktin kayda değer seviyelere bakteri ile colocalise vermedi. Bar 20 mikron temsil eder. Katsayıları R ve My B. ve C. değerleri üçten fazla deneyler yukarıda açıklandığı gibi Volocity yazılımı kullanılarak elde edilmiştir.