Experimentele modellen voor Studie van het retinale pigmentepitheel fysiologie en pathofysiologie

1. Menselijk foetaal weefsel Alle menselijke weefsels gerelateerd onderzoek volgt de principes van de Verklaring van Helsinki en de NIH Institutional Review Board. Foetale ogen zijn verkregen door een onafhankelijke souteneur, Advanced Bio-Resources (ABR, Alameda, CA), van willekeurige donoren op 16 tot 22 weken van de zwangerschap, geplaatst in RPMI-1640 medium met buizen (geleverd door ABR), verpakt op ijs en geleverd door een overnachting prioriteit bezorgdienst. Weefsels blijven levensvatbaar tot 48 uur na de enucleatie. 2. Celkweekmedium MEM-alpha gemodificeerd medium (Sigma-Aldrich) wordt gebruikt als de basis medium tot 5% voor te bereiden en 15% serum-bevattende media voor het kweken van RPE cellen (RPE medium; onderstaande tabel 1). Naam Sigma Gibco Aantal Opslagruimte MEM, alpha wijziging M-4526 500 ml +4 ° C N1 te vullen N-6530 5 ml +4 ° C Penicilline-streptomycine 15140-148 5 ml -20 ° C Glutamax – I 35050 5 ml -20 ° C Niet-essentiële aminozuren M-7145 5 ml +4 ° C THT * -80 ° C Taurine T-0625 125 mg Hydrocortison H-0396 10 10 pg Triiodo-thyronin T-5516 0,0065 ng Foetaal runderserum ** 5% of 15% -80 ° C Tabel 1. Human Foetale RPE Medium componenten voor de bereiding van 500 ml Medium * THT wordt gemaakt door het oplossen van taurine-hydrocortison-triiodo-thyronin in een 1,5 ml PBS voordat u het medium. Meerdere fracties zijn gemaakt en opgeslagen bij -80 ° C tot het kweken van de voorbereiding van het kweekmedium te vereenvoudigen. ** Foetale bovine serum is niet verkregen van Sigma-Aldrich of Gibco. Foetaal runderserum worden gebruikt in de media bereiding wordt verkregen uit Atlanta Biologicals (Norcross, GA). Elke fles van het serum is warmte geïnactiveerd (56 ° C gedurende 1 uur) voorafgaand aan het gebruik. Om ervoor te zorgen celcultuur consistentie van grote hoeveelheden serum van dezelfde partij worden gekocht en opgeslagen in -20 ° C tot ze worden gebruikt voor media voorbereiding. Dun gezaaid cellen van een specifieke partij hfRPE cellen worden gekweekt in 24 – of 12 – goed platen voor een paar weken in media die 20% FBS uit verschillende partijen. De snelst groeiende melanated cellen met de meest klassieke RPE morfologie (kasseien) geven een juiste serum veel dat kan worden gebruikt voor celkweek. Celkweekmedium bevat ook: N1 supplement (Sigma-Aldrich) 1:100 ml / ml, Glutamax / penicilline-streptomycine 1:100 ml / ml (Gibco), en niet-essentiële aminozuren oplossing (Sigma-Aldrich) 1:100 ml / mL. Daarnaast, hydrocortison (20 ug / L), taurine (250 mg / L), en triiodo-thyronin (0,013 ug / L) (THT) is vooruit bereid door het oplossen van deze drie componenten in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 1:500 (ml / ml). Hoeveelheden van THT worden bewaard bij 80 ° C tot toegevoegd aan het RPE medium. 3. Cel Cultuur Bij ontvangst, intact zijn bollen gespoeld in antimycotische antibiotica-oplossing (verdund tot 10x;.. Cat geen 15240-096, Invitrogen) plus gentamicine (1 mg / ml) gedurende 3 tot 5 minuten (figuur 1 hieronder). Figuur 1. Na incubatie antibiotica zijn afgespoeld tweemaal met medium zoals HBSS of PBS. Een oogbol op het moment dat wordt overgedragen aan 10 cm Petrischaal met gecoat met Sylgard-184 (WPI) en vastgezet met 27G naalden. Met behulp van kaal gekapt SidePort mes (Alcon), een incisie wordt gemaakt door de sclera onder het corpus ciliare (1 / 3 van de afstand van oog evenaar naar de voorste oppervlak). Deze incisie wordt gebruikt om een ​​cirkelvormig gesneden voor het verwijderen van het voorste gedeelte oog te starten. Deze snede wordt gemaakt met behulp van een wolfraam-carbide coating gebogen iris schaar met een mes gekarteld (FST). Voorafgaand aan het verwijderen van het voorste deel van het oog, wordt een snede gemaakt door het glasachtig lichaam om te voorkomen dat het losmaken van de retina van de RPE op de achterste paal. Na het voorste deel van het oog is verwijderd, wordt de achterste paal geïncubeerd met dispase-I-oplossing (2 U / mL, cat geen 04942086001,.. Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) in 5% serum met medium voor 40-60 minuten in 37 ° C-5% CO 2. Na de dispase behandeling worden de achterste palen overgebracht naar een HBSS in petrischalen met siliconen vulling (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) en ontleed in kwadranten of grotere stukken voldoende plat weefsels. Dan het netvlies wordt voorzichtig verwijderd met een pincet. Single-cell RPE lagen afgepeld in bladen en direct verzameld in koude trypsine-EDTA (Gibco, # 25200-056) oplossing. Nadat de RPE worden verzameld, zijn buizen met weefsels in trypsine-EDTA verzegeld en overgebracht naar waterbad gedurende 10-15 minuten bij 37 ° C. Na 10 minuten incubatie, zijn de buizen krachtig geschud om RPE scheiden in kleine clusters. Als de scheiding niet compleet is, zijn de buizen terug geplaatst in het water bad voor nog eens 5 minuten. Na het trypsine-EDTA incubatie worden de buizen gecontroleerd op mogelijke niet-opgeloste gemengde cel clusters. Alle waargenomen clusters zijn verwijderd met behulp van fijne getipt glas Pasteur pipet. Na het stoppen met draaien (1,4 rpm op klinische centrifuge voor 4 min.), zijn hfRPE cellen opnieuw gesuspendeerd in 15% RPE media en vervolgens in Primaria kolven (bijvoorbeeld: cat geen 08-772-45, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.. ). Dit medium wordt vervangen na een dag met 5% serum-bevattend RPE medium, en de daaropvolgende wijzigingen zijn aangebracht om de 2 tot 3 dagen. Na 3 tot 4 weken, de cellen werden samenvloeiende en gelijkmatig gepigmenteerd. Vervolgens worden ze getrypsiniseerd in 0,25% trypsine-EDTA voor 10 tot 15 minuten, opnieuw gesuspendeerd in 15% serum-bevattende RPE celcultuurmedium, en gezaaid op clear cell cultuur inzetstukken in de 150 tot 200K cellen per well (Transwell, Corning Costar, Corning, NY), met behulp van 12-mm diameter inserts, 0,4-um poriën, polyester membranen (bijvoorbeeld: cat geen 07-200-161, Fisher Scientific)… Voor zaaien, werden de putjes bekleed met menselijke extracellulaire matrix (10 ug in 150 ul per putje HBSS, cat geen 354.237,.. BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey) en uitgehard met UV licht in de kap voor 2 uur. In sommige gevallen werd de behandeling met trypsine procedure herhaald voor de tweede keer, om de cellen die niet los na de eerste behandeling met trypsine te verzamelen. Hetzelfde protocol (met uitzondering van coating met ECM) werd gebruikt om de cultuur cellen op de kolven om de P1 populatie van cellen te genereren. Deze cellen werden gebruikt in experimenten toen zij had een totaal weefsel weerstand van ≥ 200 Ω • 2 cm en werden gelijkmatig gepigmenteerd. Klik hier voor een grotere figuur 1 . 4. Stap voor stap procedures Bereid 12-well plaat met meerdere oplossingen (voor elk oog vier putten nodig): Voeg 10x antibiotica antimycotische oplossing – een goed / oog Voeg PBS / HBSS oplossing voor het spoelen – 2 putten / oog toe te voegen dispase oplossing – een goed / oog Bereid ontleden petrischaal met het uitpakken van 5 fixatie naalden en te vullen met HBSS Pak ogen en plaats ze in antimycotische antibiotica-oplossing voor 3-5 min. (opgesteld in stap 1) Ogen in twee putten (opgesteld in stap 1) met PBS / HBSS, dan ze naar ontleden schotel. Trim veel spier-en bindweefsel rond de ogen Met behulp van 27G naalden beveiligde (pin naar silicium basis) ogen in ontleden schaal afstemmen op een manier waar de cornea gezichten op. Met behulp van SidePort mes maken incisie onder de cornea, waar de ronde cut zal beginnen Met behulp van iris schaar maken snij je rond de ogen, vervolgens met behulp van dezelfde schaar snijden door glasvocht en til voorste deel van het oog. Opmerking: In stap 3 tot 8 voorkomen overmatige mechanische druk om oogbol. Overdracht open oog in dispase-oplossing (bereid in stap 1) Incubeer oogschelp voor 40-60 minuten bij 37 ° C met 5% CO 2 Vervang HBSS oplossing in ontleden schotel met verse een. Transfer oog van dispase oplossing voor ontleden schotel. Positie oog in petrischaal (oogbol cup naar boven) en zet met twee 27G naalden. Voorzichtig lift gedeeltelijk gescheiden netvlies en het gebruik van het netvlies een schaar knippen netvlies uit de buurt van de oogzenuw. Gooi netvlies. Met behulp van iris schaar maken een incisie van de periferie van het oog naar oogzenuw. Met behulp van alle vijf de 27G naalden plat eye het maken van RPE laag netjes uitgerekt. Met behulp van het netvlies schaar maken cirkelvormige snij je rond de oogzenuw scheiden RPE laag van gehechtheid aan de oogzenuw. Opmerking: de stappen 13-17 kan gedaan worden met een lage vergroting of zonder stereo microscoop Stel stereomicroscoop naar 250x vergrotingof meer en vinden rand van de RPE vel dicht bij de oogzenuw langs de snede gemaakt door iris schaar. Met behulp van twee aparte tang RPE-Bruch's membraan van de choroïdale weefsel laag. Het kan een paar pogingen om de buurt te vinden langs de rand waar de aansluiting van de RPE en choroidea het zwakst is. Plaats RPE vellen in de koude trypsine-EDTA-oplossing in 15 ml buis Nadat de RPE worden verzameld, cap en overdracht buizen met weefsels in trypsine-EDTA in het waterbad voor 10-15 minuten bij 37 ° C. Na 10 minuten incubatie, schud krachtig 15 ml buizen aan RPE scheiden in kleine clusters. Als de scheiding niet compleet is, terug te plaatsen buizen in het water bad voor nog eens 5 minuten. Controleer de buizen voor mogelijke niet-opgeloste gemengde cel clusters. Elke waargenomen clusters worden verwijderd met behulp van fijne getipt glas Pasteur pipet. Spin down (1,4 rpm op klinische centrifuge voor 4 min.) hfRPE cellen te verwijderen supernatant en resuspendeer cellen in 15% RPE media (9 ml totaal) Zet 3 ml celsuspensie in Primaria kolven voeg 2 ml vers 15% RPE media, plaatsen kolf in couveuse tot de volgende dag (37 ° C, 5% CO 2) 5. Representatieve resultaten Functionele validatie van hfRPE celkweek In eerdere experimenten hebben we gebruik gemaakt van deze primaire culturen om de uitdrukking, polarisatie en functie van plasma-membraan transport eiwitten te bepalen en specifieke signaalwegen die regelen RPE functie 1-11 Deze kenmerken te identificeren als ze zijn opgebouwd geven een validatie set eigenschappen die kunnen worden toegepast naar elke cel generatie. De experimenten hieronder samengevat identificeren van de eiwitten die transepitheliaal vloeistof transport en de integriteit van de paracellulaire pad te bepalen. Deze in vitro experimenten zijn gevalideerd in een diermodel van het netvlies opnieuw herbevestiging 6. Figuur 2. Lokalisatie van de CFTR in hfRPE cellen Links bovenste paneel:. CFTR werd gedetecteerd in hfRPE cellen met behulp van membraan-verrijkte extracten. M, moleculair gewicht marker, baan 1, de grote rijpe (band C) en onvolwassen (banden A en B) Center onderste paneel: immunofluorescentie lokalisatie van CFTR (groen label) Top rechterkant van het scherm: vergrote doorsnede uitzicht door de Z-vlak zien.. een maximale intensiteit projectie door de z-as. ZO-1 (aangeduid als rood) fungeert als een tight junction marker afbakenen van apicale en basolaterale zijde van de RPE. DAPI (blauw) labels van de kernen dicht bij de basale membraan bevindt. ZO-1 verschijnt als geel / oranje, omdat de rode label overlappingen groene fluorescentie van CFTR. Figuur 3. IFNy-geïnduceerde fysiologische veranderingen in hfRPE A:. Toevoeging van IFNy aan de basale bad toegenomen transepitheliaal vloeistof transport (J v) over monolayer van primaire, gekweekte cellen hfRPE J v is uitgezet als een functie van de tijd in de top-trace en de netto-vloeistof. absorptie (apicaal naar basaal bad) wordt aangegeven door positieve waarden; transepitheliaal potentieel (TEP) en de totale weefsel weerstand (R T) worden uitgezet als functie van de tijd in de bodem sporen. B: Toevoeging van CFTRinh-172 (5 uM) om de basale bad remde de IFNy gestimuleerde J v te verhogen. Hieronder is een voorbeeld van een diermodel experimenten bevestigen hfRPE in vitro bevindingen. In dit experiment werd kunstmatig gecreëerd netvliesloslating aanzienlijk verminderd na toevoeging van IFNg aan de buitenkant oogoppervlak (Figuur 4 A, B). Dit effect kan gedeeltelijk worden geblokkeerd door: (1) toevoeging van cAMP blokker (figuur 4D), (2) volledig geblokkeerd na toevoeging van JAK + cAMP-blokkers. Afbeeldingen hieronder zijn verkregen met behulp van oktober scanner. Figuur 4. In vivo experimenten loslaten van het netvlies. De procedures voor deze in vivo experimenten zijn eerder in detail beschreven 6. In deze experimenten werden netvliesloslatingen gemaakt in rat oog door injectie van 0,5-3 pi van gemodificeerde PBS-oplossing in de subretinale ruimte (SRS), alleen of met een combinatie van JAK-STAT en PKA pad remmers. Elk experiment heeft een eerste controleperiode van 40-70 minuten na het aanmaken van de netvliesloslating. Gedurende deze tijd, was de mate van verandering van de blaar volume gemeten blaar stabiliteit te verzekeren. Optische coherentie tomografie beeldvorming (Instituut voor Toegepaste Fysica, Russische Academie van Wetenschappen, Nizhniy Novgorod, Rusland) werd gebruikt om het tijdsverloop van het volume te wijzigen in de SRS te meten. Het tijdsverloop van de re-attachment volume verandering werd gemeten door optische coherentie tomografie (OCT). Oktober beelden van vier verschillende experimenten (panelen aan de linkerkant, AD) dat een verandering in onthechting maten show (pijlen in A, B en D) na de toevoeging van IFNy op de voorste oppervlak voor 40-70 minuten. Panelen A en B laten zien dat IFNy Jv gestegen van haar controle-tarief (≈ 2 ui • 2 cm • hr -1) tot 14 en 12 ui • 2 cm • hr-1, respectievelijk. Na toevoeging van JAK-STAT pathway en PKA-remmers (C en D), de IFNy – geïnduceerde absorptie tarieven werden aanzienlijk verminderd tot 0,2 en 7,9 pl • 2 cm • hr-1, respectievelijk. Pijlen geven de grens van de blaar voor een vergelijking met het gebied binnen de stippellijn, (vanaf volume). Rechterzijde van figuur: top panel-overzicht van de gemeten Jv tarieven van een aantal experimenten, middelste paneel-film ( klik hier ), onderste paneel-3D delen van experiment samengevat in B. pseudocolor in blauw geeft aan ruimtelijke omvang van onthechting op t = 0 en 40 min na toevoeging van INFγ. Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Association for Research in Vision en Oogheelkunde verklaring. Het protocol werd goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de National Institutes of Health.