細胞の電気融合を蛍光顕微鏡で可視化

I.はセルトラッカーCMFDAとCMRAで細胞をロードする実験は、マウスのメラノーマ細胞株（B16 – F1）の事前に準備された細胞について実施した。細胞は、投与16、0.15 mg / mlのL -グルタミン、10％ウシ胎児血清を含むDMEM培地（ダルベッコ改変イーグル培地）で70〜80％コンフルエントになる2つの分離25cm 2の培養フラスコ（TPP、ZDA）で栽培されています/ mlのゲンタマイシン（Sigma – Aldrich社、ドイツからのすべて）、200単位/ ml crystacillin（Pliva、クロアチア）、および37℃、5％CO 2でインキュベート℃のオリジナルの染料の50μgのために（Sigma – Aldrich社、ドイツ）のDMSO（グリーンCMFDA用とオレンジCMRAため、それぞれ）10.76μlを、9μlを添加して細胞のトラッカー（インビトロジェン社、米国）の2つの10 mMのストック溶液を準備するインビトロジェンのバイアル。ストック溶液は、℃で数ヶ月間で4冷蔵庫で保存することができます。 DMSOの結晶が溶解するまで実験を開始する前に、ソリューションのウォームアップを行います。 重炭酸フリークレブス- Hepes緩衝液（130 mMのNaCl、4.7 mMの塩化カリウム、1.2 mMのMgSO 4を 、1.2 mMのKH 2 PO 4、29.6 mMのD -グルコース、1.3 mMのCaCl 2を 、10mMのHEPES、pH7.4）を準備する。 2つの15エッペンドルフチュー​​ブに別々に重炭酸フリークレブス- Hepes緩衝液3mlに各ストック溶液2.1μL（それぞれ10 mMのCMFDAまたはCMRAを、）ミックス。これは約7μMCMFDAを（またはCMRA）を含む"ローディングソリューション"を得られます。 重炭酸フリークレブス- HEPES緩衝液で細胞を2回リンスし、フラスコにソリューションを読み込んで挿入。 37℃5％CO 2で30分間細胞をインキュベート℃にこの最初のインキュベーションの試薬は、細胞膜を自由に通過する時には、いったん細胞の中に、試薬は、細胞非透過性の蛍光反応生成物に変換されます。 37で最初のインキュベーションの後、リンス、5％CO 2でさらに2時間培養培地で細胞をインキュベート℃に両方のフラスコに細胞をトリプシン処理（CMFDAとCMRA搭載）および50 ml遠心チューブに比1:1（TPP、ZDA）で一緒に赤と緑のセルを混在させること。 DMEM培地で希釈することによりまたは遠心分離による濃縮により、5 × 10 6細胞/ mlに細胞濃度を調整します。 24マルチウェルプレート（TPP、ZDA）の各ウェルに細胞懸濁液の20μlのドロップを置きます。 ℃で20分間、ややもの表面に付着し、細胞の接触を確立できるように37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートする。 II。電気融合 isoosomolarリン酸カリウム緩衝液（10mMのKH 2 PO 4、10mMのK 2 HPO 4、1mMのMgCl 2を 、250mMスクロース）とhypoosmolarリン酸カリウムバッファー（10 mM KH 2 PO 4、10mMのK 2 HPO 4、1mMのMgCl 2を 、75 mMスクロース）の準備。 、顕微鏡ステージ上に細胞をマルチウェルを配置ウェルの下部に位置電極を、パルス発生器に接続します。 isoosomolarリン酸カリウム緩衝液1mlで細胞を洗浄。細胞の腫脹を誘発するためにhypoosmolarリン酸カリウム緩衝液350μlを添加します。バッファは、電極をカバーする必要があります。 電気パルスを適用する前に2分間hypoosmolarバッファーで細胞を残す。この時間の間にインテリアや細胞の外側との間の浸透圧の不均衡に起因する細胞内への水分の流入は、細胞容積の増加を引き起こす。細胞は彼らの最大のボリュームに近づく際には、電気パルスが調節容量の減少を開始する前に、適用する必要があります。 最適な電気融合を実現し、細胞の生存を維持するために、電気パルスの最適なパラメータを使用する必要があります。これらは、[1]を使用する細胞株に依存する。この実験では、8の矩形パルス（1 Hzで100μsの間の持続時間と各）の列車は、エレクトロポレーションのデバイスを（このケースCliniporator、ジェーア、イタリア）を使用して、各サンプルに適用されます。パルスは、よく制御を除いて、各ウェルに電極間に約1200 V / cmの電場を作る、0.8mmの直径とそれらの間に5 mmの距離で二つの平行な白金/イリジウムワイヤー電極に配信されます。 パルスの配達後10分間静細胞を残す。蛍光および位相差顕微鏡による核融合の利回りを決定します。 III。画像取り込みと融合の収量の決定細胞は、目的（x20）をと冷却CCDカメラ（VisiCam 1280、Visitron、ドイツ）を装備した蛍光顕微鏡を（我々の場合ツァイスAxioVert 200、ツァイス、ドイツ）を用いて観察される。画像は、MetaMorph 7.1.1（Molecular Devices社、米国）に買収されていますが、他の同じような買収のソフトウェアを使用することもできます。 CMFDAは548 nmで492 nmの単色光分光器（ポリクロームIV、Visitron、ドイツ）とCMRAで興奮している。 CMFDAとCMRAの蛍光は（D605/55m、Cの2つの発光535 nmの中心フィルター、つ（HQ535/30m、CMFDA用）と510nmで他の中心を使用して取得されるMRA、クロマ、米国）の両方。ダイクロイックミラー（Q515LP）を使用すると、チャンネルのクロストークを防止。 各ウェルに5つのランダムに選択されたフィールドには3つのイメージを（位相コントラスト、赤色および緑色蛍光）を取得。各画像の三つ組から3チャンネルの画像を作成します。そのようなイメージでは蛍光を発する細胞質は細胞膜と一緒に見ることができます。融合細胞は、このように容易に決定することができます[図1]。 各3チャンネルの画像で細胞（赤、緑、二重に蛍光）の3種類すべてをカウントします。各画像のすべてのセルの数を二重に蛍光細胞の数を割ることによって二重に蛍光細胞の割合を決定する。核融合の利回りは、融合細胞の半分から2を乗じて二重に蛍光細胞が（同じ色のヒューズの際の細胞）が検出されていないのパーセンテージとして定義されています。 代表的な結果 図1電気融合後のB16F1細胞の3チャネルの顕微鏡像：。位相コントラスト、CMRA蛍光（548 nmで励起）とCMFDA蛍光（492 nmで励起）、客観的な倍率20倍