DNA tabanlı Balık Türleri Tanımlama Protokolü

1: DNA Ekstraksiyon Balık Örnekleri hazırlayın Test edilecek her balık örnek için tek bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpe 10 mg ve 1 g (çiğ ya da pişmiş) arasında ağırlığında balık dokusunun bir parçası koyun. Aşağıdaki resimde örnek büyüklüğüne göre bir çiğ balık örneği ağırlığını tahmin etmek için bir kılavuz olarak kullanın. Şekil 1. Balık Örneklerinin Kitle Tahminleri Örneklem Büyüklüğü geçerli. 65 Pre-sıcak Proteinaz K Sindirim Tampon ° C'de bir inkübatör veya su banyosunda 5 dakika. Proteinaz K Proteinaz K Sindirim Tampon ve Proteinaz K örnek başına 20 ul 200 ul birleştirerek bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Not: Her kullanımdan önce Proteinaz K taze bir çalışma çözeltisi hazırlayın. 220 balık örnek her 1.5 ml tüp Proteinaz K çözüm ul ekleyin. Tüpler 65 ° C'de bir inkübatör veya su banyosunda 10 dakika. Pelet herhangi bir sindirilmemiş dokuların xg 14.000 3 5 dakika için bir mikrosantrifüj tüpler Spin. 1.5 ml taze bir tüpe her süpernatant 150 ul aktarın. Sindirilmemiş, tüp ya da tüpün üst kısmında görülebilir herhangi bir yağlı madde alt herhangi bir malzeme transferi kaçının. Süpernatant Bu borular örnekleri hangi genomik DNA çıkartılacaktır. 2: Genomik DNA ayıklayın Steril bir konteyner (polipropilen tüp ya da cam şişe),% 90 sulfolane 320 ul ve Nükleik Asit Bağlama Buffer numune başına 170 ul birleştirerek sulfolane ve Nükleik Asit Cilt Tampon çalışan bir solüsyon hazırlanır. Bu karışımı bir sonraki 4 hafta içinde incelemek için planladığınız gibi birçok örnekleri işlemek için yeterli miktarda hazırlamak isteyebilirsiniz. Bu karışım, oda sıcaklığında 30 gün kadar saklanabilir . Depolama sırasında karışımı ışığa maruz bırakmaktan kaçının. Her balık örnek sulfolane / Ciltleme Tampon karışımı (Yukarıda 1. adımda hazırlanan) 490 ul ekleyin. Vortex veya pipetlemeyin homojenize kadar art arda örnek. Bu karışımı Ayrıca her numunenin toplam hacmi 640 ul getirecektir. Her numune, 2 ml priz tüp içinde oturan (sağlanan) ve spin fincan üstüne tüpün kapağı ek bileşenini bir DNA Cilt Spin Kupası aktarın. Spin fincan matris üzerine DNA yüklemek için 1 dakika 14.000 xg'de için mikrosantrifüj örnekleri Spin. Çıkarın ve korumak spin bardak ve filtratlar atın. Her bir örnek için, priz tüp spin bardak yerine, daha sonra 500 1x Yüksek Tuz Yıkama Tamponu ul ekleyin ve tüp kap. 1 dakika 14.000 xg'de mikrosantrifüj örnekleri Spin. Çıkarın ve korumak spin bardak ve filtratlar atın. Her bir örnek için, priz tüp spin bardak yerine, daha sonra% 80 etanol 500 ul eklemek ve tüp kap. 1 dakika 14.000 xg'de mikrosantrifüj örnekleri Spin. 500 ul% 80 etanol ile toplam 3 yıkama için adım 7 ve 8 iki kez daha tekrarlayın. % 80 etanol içinde üçüncü bir yıkamadan sonra, kaldırmak ve spin bardak korumak ve filtratlar atın . Priz tüpler spin bardak değiştirin ve kuru fiber matris 14.000 xg'de 2 dakika boyunca mikrosantrifüj döndürün. 1.5-m1 toplama tüpleri spin bardak aktarın. 100 ul Elüsyon Tampon her spin fincan fincan içinde doğrudan fiber matris üzerine ekleyin. Toplama tüplerin kapakları spin bardak üzerine çekin ve 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. 1 dakika boyunca maksimum hızda bir mikrosantrifüj örnekleri Spin. Saflaştırılmış DNA mikrosantrifüj tüp Elüsyon Tampon. Spin fincan atın ve tüpler kap. DNA, bir ay kadar 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Uzun süreli depolama için, DNA saklamak 20 ° C veya 80 ° C. İsterseniz, bir spektrofotometre, DNA örneklerinin konsantrasyonu ölçmek. Genomik DNA ekstraksiyonu protokolü genellikle 5 ng / ul 500 ng / ml arasında değişen bir konsantrasyon ile örnek verir. PCR-RFLP protokolü DNA örnekleri ile 0.05 ng / ul ng / ml 2000 yılına kadar her yerde değişen kuyulardan çalışır. 3: PCR Reaksiyonlar ayarlayın DNA stoku 8 ul steril, DNaz-su 32 ul ile birleştirerek bir pozitif kontrol somon DNA 50 ng / ul seyreltme hazırlayın. Karıştırmak için Vortex. Seyreltilmiş numune 4 ° C 'de ileride kullanmak üzere saklanabilir. Sırasına göre aşağıdaki tabloda bileşenleri birleştirerek reaksiyonlar hazırlayın. Belirtilen miktarlar kadar ölçekleme tarafından aynı anda çalıştırmak olacaktır PCR reaksiyonları için tek bir reaktif karışımı hazırlayıntablosu. Test DNA örnekleri yanı sıra, pozitif bir kontrol reaksiyonu ve herhangi bir şablon kontrol reaksiyon içerir. Yinelenen PCR reaksiyonları her test DNA örneği için hazırlanması tavsiye edilir. Tüm reaksiyon artı bir reaksiyon hacim fazlalığı için yeterli reaktif karışımı hazırlayın. 5 test DNA örnekleri varsa test reaksiyonlarının çiftleri dahil Örneğin, 8 reaksiyon (5 test reaksiyonlarının, 1 pozitif kontrol, 1 no-şablon kontrolü, ve 1 fazla) veya 13 reaksiyonlar için yeterli reaktif karışımı hazırlamak (10 yinelenen test reaksiyonlar, 1 pozitif kontrol, 1 no-şablon kontrolü ve 1 fazla). PCR Reaktif Karışımı Bileşen Volume 1 Reaksiyon Cilt 5 Reaksiyonlar dH 2 O, steril 9 ul 45 ul 2x PCR Master Mix 12.5 ul 62.5 ul Primer Mix 2.5 ul 12.5 ul Toplam hacim 24 ul 120 ul Vorteks reaktif karışımı, daha sonra her bir ince duvarlı PCR reaksiyon tüpü 24 ul dağıtmak. 1 ul sulandırılmış pozitif kontrol DNA pozitif kontrol reaksiyon tüpüne ekleyin. Test örneği tüplere, test DNA örneği 1 ul ekleyin. No-şablon kontrol reaksiyon için, DNA yerine 1 ul DNaz ücretsiz su ekleyin. Çapraz bulaşmayı önlemek için, her DNA örneği için taze bir pipetlemeyin ucu kullanın. Örnek ekledikten sonra, tüpün içeriğini hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleme reaksiyon karışımı. Tüpler kısaca karıştırılır ve santrifüjlenir reaksiyon tüpleri, vorteks tüpleri Cap. 4: PCR Protokolü çalıştırın Termal cycler reaksiyonlar yerleştirin ve aşağıda gösterilen PCR programı çalıştırın. PCR Bisiklete binme Protokolü Bölüm Çevrimleri sayısı Sıcaklık Süre 1 1 95 ° C 5 dakika 2 40 95 ° C 50 ° C 72 ° C 30 saniye 30 saniye 30 saniye 3 1 72 ° C 7 dakika 5: Enzimler Kısıtlama Digest PCR Ürünler Etiket 0.5 ml tüp ya da kısıtlama sindirmek reaksiyonlar için kullanılmak üzere 0.2 ml şerit tüpler. DdeI, HaeIII ve NlaIII: Her PCR reaksiyon üç farklı restriksiyon enzimleri ile sindirilir. Bu nedenle, her PCR reaksiyonu, PCR örnek adı ve restriksiyon enzimi adı ile üç ayrı tüpler etiketi. Amacıyla aşağıdaki parçaları birleştirerek DdeI sindirimler için reaktif karışımı hazırlayın. Katları kullanarak her bir bileşenin tüm DdeI sindirim reaksiyonları (artı en az bir reaksiyon hacmi fazla) için tek bir reaktif karışımı hazırlayın. PCR işlemi tamamlandıktan sonra, PCR reaksiyonları, RFLP (RFLP) analizi için restriksiyon enzimleri ile tedavi edilir. DdeI Sindirim Reaktif Karışımı Bileşen Hacim dH 2 O, steril 1.5 ul 10x DdeI Tampon 0.5 ul 10x DdeI enzim 0.5 ul Vortex reaktif karışımı, daha sonra bireysel reaksiyon tüpleri DdeI için etiketli 2.5 ul dağıtmak. Amacıyla aşağıdaki parçaları birleştirerek HaeIII sindirimler için reaktif karışımı hazırlayın. Katları kullanarak her bir bileşenin tüm HaeIII sindirim reaksiyonları (artı en az bir reaksiyon hacmi fazla) için tek bir reaktif karışımı hazırlayın. HaeIII Sindirim Reaktif Karışımı Bileşen Hacim dH 2 O, steril 1.5 ul 10x HaeIII Tampon 0.5 ul 10x HaeIII enzim 0.5 ul Vortex reaktif karışımı, daha sonra bireysel reaksiyon tüpleri HaeIII için etiketli 2.5 ul dağıtmak. Reaktif karışımı hazırlayın.Amacıyla aşağıdaki parçaları birleştirerek NlaIII sindirimler her bileşen katları kullanarak tüm NlaIII sindirim reaksiyonları (artı en az bir reaksiyon hacmi fazla) için tek bir reaktif karışımı hazırlayın. NlaIII Sindirim Reaktif Karışımı Bileşen Hacim dH 2 O, steril 1.5 ul 10x NlaIII Tampon 0.5 ul 10x NlaIII enzim 0.5 ul Vortex reaktif karışımı, daha sonra bireysel reaksiyon tüpleri NlaIII için etiketli 2.5 ul dağıtmak. Her sindirim tepki için, etiketli tüpler için uygun PCR ürününün 2.5 ul ekleyin. Tüm test PCR reaksiyonlarının yanı sıra pozitif kontrol reaksiyon üç restriksiyon enzimleri ile sindirilir gerekir. Vorteks sindirim reaksiyonları ve ardından kısa bir süre tüpler santrifüj. 37 ° C'de 2 saat boyunca tüm sindirim reaksiyonları inkübe edin. Bu inkübasyon termal cycler yapılabilir. İsterseniz, reaksiyonlar 37 ° C gece bırakılabilir. 65 ° C'de 15 dakika süreyle reaksiyonlar aktarın. Bu adım, termal cycler yapılabilir. Her reaksiyon ve vorteks 60 mM EDTA (kit ile birlikte verilen) 1 ul ekleyin. 6: kısıtlama sindirmek desen analiz Jel boya karışımı hazırlayın, DNA çip çip emişli istasyonu yer ve DNA çip üzerine karışımı yük. Pipetleyin 5 merdiven sembolü olan ve her birinin içine çip üzerinde 12 örnek kuyuların işaretlenmiş içine DNA marker ul. DNA göstergesi yeşil kapaklı bir tüp içerisinde DNA 1000 Reaktif Kiti içinde sağlanır . Iyi bir merdiven sembolü ile işaretlenmiş içine DNA merdiveni pipetleyin 1 ul. DNA merdiveni, sarı-kapaklı bir tüp içerisinde DNA 1000 Reaktif Kiti sağlanmaktadır. DNA örneklerinin her biri için, aşağıdaki şekilde yönergelere göre çip üzerinde 12 örnek kuyulardan biri haline her bir kısıtlama sindirimi reaksiyon pipetlemeyin 1 ul. Bu yaklaşımı kullanarak, kuyular 1-3, pozitif kontrol örneği için 3 sindirim reaksiyonlar için, kuyular 4-6 test örneği 2 3 sindirim reaksiyonlar için test örneği 1, 7-9 kuyuları için 3 sindirim reaksiyonlar için, ve test örneği, sindirim sırasında üretilen parçası uzunlukları belirlemek için Agilent 2100 Bioanalyzer üzerinde kısıtlama sindirimi reaksiyonlar 3.Analyze 3 sindirim reaksiyonlar için kuyular 10-12. Agilent DNA 1000 Kit Rehberi Bioanalyzer laboratuar yongaları çalıştırmak için tam talimatlar vardır. Kısa bir protokol rahatınız için aşağıda verilmiştir. Şekil 2. Çip üzerinde Örnekleri Örgütü. Kullanılmayan kuyu içine az 4 DNA örnekleri, su pipetlemeyin 1 ul varsa. 4 DNA örnekleri daha fazla varsa, birden fazla çip çalıştırmanız gerekecektir. Her çip üzerinde pozitif kontrol örneği çalıştırmak için gerekli olduğunu unutmayın. 2400 devirde 60 saniye IKA vorteks karıştırıcı ve vorteks adaptör çip yatay yerleştirin. Agilent 2100 Bioanalyzer içine çip takın ve çip çalıştırmak başlatmak. Aracı kapsamında gelen ham sinyalleri görüntülenir. Vadede bittikten sonra, zirveleri tepe ayarları bulmak algoritma kullanarak tüm örnekler için tanımlanır. Algoritma, gerçek bir zirve algılamak için başarısız oldu düşünüyorsanız, algoritma pik tanımlamanıza olanak sağlar bir değer Yükseklik Eşik set düşürebilir . Testi bağlamda gidin ve Chip Özet sekmesini seçin. Örnek Adı alanında, aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi, çip üzerinde tüm 12 kuyu için bir örnek adı girin. Şekil 3. Chip Özet Tab Adı Entry örnek. 7: RFLP Maçlar kullanarak test örneği türlerin tanımlanması Agilent yazılımı uygulama RFLP Decoder sindirim reaksiyonlarda üretilen parçası uzunlukları dayalı test DNA örnekleri için balık türlerini tanımlamak için kullanılır. Pozitif Kontrol Kısıtlama Enzim Beklenen Ürün Boyutu (bp) DdeI 117 Tablo 7 Beklenen DNA Fragment Boyutları , 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 NlaIII 459 talimatları burada sağlanan RFLP Maçlar varsayılan analiz ayarları kullanabilirsiniz. Yazılım işletim ve ekran yorumlama hakkında ayrıntılı bilgi için yazılım yardım sistemi bakın. RFLP Decoder programı başlatın. Dosya> Aç> Dosya XAD tıklayın. Aç iletişim kutusu will açmak. Restriksiyon sindirimi reaksiyonlar dahil DNA çip için XAD dosyayı seçin. Aç seçeneğini tıklatın. Çip üzerinde yüklenen örnekleri listeleyen bir iletişim kutusu açılacaktır. Bir DNA örneği karşılık gelen üç sindirim reaksiyonlar seçin ve açılan Enzim sütununun altında menüleri kullanarak her bir örnek için uygun bir restriksiyon enzimi belirtin. Aşağıdaki şekilde, Enzim sütun, DNA Sample 1 doldurulacak olmuştur. Şekil 4. Her Sample Kısıtlama Enzim belirtme. Düşük marker "% min pik yüksekliği etiketli alanında, varsayılan değeri% 10.0. Gerekirse, kaçırılan küçük doruklarına tanımlamak için bu değer indirdi ya da non-spesifik gürültü kaynaklanan doruklarına atmak için kaldırdı olabilir Elektroferogram. min pik yüksekliği değeri için herhangi bir ayarlama yaptıktan sonra Yeniden Entegre tıklayın. Şekil 5. Asgari tepe yüksekliği atama. Kireç iletişim kutusunun altındaki tıklayın. Bioanalyzer vadede elde edilen parça uzunluk verileri yazılım alanları doldurmak. Ekranın sol üst köşesindeki skor açılan listesinde, veri analizi için uygun bir algoritma seçin . Analiz edilen balık numunesi tek bir balık türü oluşuyorsa puanı açılan listesinde Zar (Nei Li) seçin. Karışım seçin örnekleri türlerinin bir karışımı oluşabilir. Ekranın alt kısmında tablo etiketli kombine skoru her üç sindirim reaksiyonlar sonuçlarına göre en iyi türlerin eşleşen listeler. Türün adının yanı sıra ortak adı (aşağıya bakın) tabloda yer almaktadır. Mükemmel maçları (1 puan ile) yeşil vurgulanır. Sarı vurgulanır eşleşir yakın olarak kabul edilir. Bu türler için FishBase web sayfası getirmek için bir tür adı üzerine çift tıklatın. Şekil 6. Türlerin tanımlanması Sindirim dayanarak. Ekranın üst kısmında alt kesim ve maç tolerans alanları, en iyi türlerin maçın skorunu geliştirmek için varsayılan ayarları. Düşük kesme değeri alanında belirlenen uzunluğundan daha kısa olan herhangi bir parçaları atmak için kullanılır . Maç tolerans değeri bir parçası uzunluğu dikkate alınması gereken bir maç tahmin parçası ne kadar yakın olmalıdır belirler. Bu aynı yonga üzerinde alındı, geri kalan DNA örnekleri için 4 ile 8 arasındaki adımları tekrarlayın. 8: Temsilcilik Sonuçları: 4 farklı balık türlerinin kısıtlama sindirimi örnekleri ile bir Bioanlyzer jel bir görüntü aşağıdaki şekilde gösterilmiştir. Pozitif DNA örneği için beklenen sonuçlar aşağıdaki tabloda özetlenmiştir. Şekil 7. Kısıtlama sindirmek reaksiyon örnekleri Bioanalyzer jel görüntüsü. Her jel şeritli bu tepki olarak kullanılan restriksiyon enzimi ile etiketlenir. Somon Pozitif Kontrol Beklenen DNA Fragment Boyutları Şekil 8. Somon Pozitif Kontrol Beklenen DNA Fragment Boyutları.