Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels

De volgende methode schetst een protocol voor het imago van de analyse van genexpressie met behulp van een geautomatiseerd systeem voor het verzamelen afbeelding. Voor het gemak van uitleg, was de algehele aanpak opgesplitst in vier stappen: 1) zaad voorbereiding, 2) gen introductie met behulp van deeltjesbombardement, 3) robot beeldcollectie, en 4) beeldanalyse. Hoewel deze algemene methodiek kan worden gebruikt voor een breed scala van andere toepassingen, zijn de huidige sets van protocollen gebaseerd op het gebruik van het groen fluorescerend eiwit (GFP) gen, dat is een handig reporter gen voor het bijhouden van genexpressie in hetzelfde stuk van levend weefsel in de tijd. I. Seed Voorbereiding Lima boon (. Phaseolus lunatus cv Henderson-Bush) zaden kunnen worden gekocht, of idealiter geoogst van planten gekweekt in een groeikamer (50% relatieve vochtigheid, 16 / 8 uur licht: donker, 25/23 ° C dag / nacht). Na de oogst zaden kwaliteit kan worden gehandhaafd door het opslaan van zaden bij -20 ° C. Bereid Magenta GA7 containers voor kiemende zaden. Vouwen filter papier of papieren handdoeken te passen in de bodem van Magenta dozen. Voeg ~ 25 ml gedeïoniseerd water om elke container op papier handdoeken bevochtigen, en uit niet-geabsorbeerde giet water. Autoclaaf papier-bevattende boxen bevochtigd gedurende 20 minuten. Met behulp van 50 ml voor eenmalig centrifugebuizen, steriliseren zaden in een 10% commercieel bleekmiddel-oplossing (20 zaden in 20-40 ml) gedurende 20 min met schudden op een tolbrekers shaker bij 60 rpm. Opmerking: Alle van de volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap. Spoel zaden 4-7 keer met steriel gedemineraliseerd water met een zacht schudden 30 seconden tijdens elke spoelen. Plaats 5-6 steriele zaden tussen laagjes van gevouwen papier zich in elke steriele Magenta box. Incubeer zaden voor 4 dagen onder de volgende voorwaarden: 25 ° C, 16 / 8 uur licht: donker en 40 μEm -2 s -1. II. Gene Inleiding met deeltjesbombardement Bouw genconstructen met behulp van uw favoriete expressievector met een reporter-gen die kunnen worden gecontroleerd in levende weefsels. Wij hebben een hoog kopie-aantal expressievector nuttig voor de promotor en promotor element analyses. Deze vector bevat het GFP-gen die wordt gebruikt om promoter / promotor element functie in getransformeerde weefsel te visualiseren. Ongeveer 1-2 uur voor bombardement, accijnzen lima bonen zaadlobben van kiemen zaailingen en verwijder het zaad jassen. Zaadlobben geschikt voor het bombardement moet worden geel aan het licht groen, vlak en vrij van enige schade die zou kunnen interfereren met verdere beeldanalyse. Plaats zaadlobben op OMS kweekmedium met MS-zouten een, B5 vitaminen 2, 3% sucrose en 0,2% Gelrite (pH 5,7) onmiddellijk na het weggesneden. Neerslaan van de DNA-construct op M10 wolfraam deeltjes (Sylvania, Towanda, PA, USA). In een 0,6 ml microfugebuis, voeg 25 ul wolfraam deeltjes (deeltjes zijn geresuspendeerd in steriel water, 100 mg ml -1, vlak voor gebruik), 5 ul DNA (1 ug ul -1), 25 pi 2,5 M calciumchloride (Sigma -Aldrich Cat. C3881-500G) en 10 pi 100 mM spermidine (Sigma Cat. S-2626). Vortex kort om goed te mengen alle componenten. Incubeer de DNA voorbereiding op ijs gedurende 5 minuten. Dan, te verwijderen en gooi 50 ul supernatans. Resuspendeer de DNA-gecoate deeltjes door vortexen en onmiddellijk verwijderen van een 2 pi aliquot deel. Herhaal deze vortexen stap iedere keer een hoeveelheid wordt verwijderd uit de buis. Gecoate deeltjes moeten worden bewaard in ijs en binnen 15 minuten. Door de bovenkant van een injectiespuit filter, plaats 2 pi gecoate deeltjes in het midden van het filter scherm. Plaats het filter met de gecoate deeltjes in het filter holding unit binnen het deeltje pistool kamer. Plaats een lima boon zaadlob adaxial kant naar boven op een baffle en plaats de baffle in het deeltje pistool kamer. De baffle, die bestaat uit een scherm gesmolten op de bodem van een beker, wordt gebruikt als een platform om weefsels te ondersteunen tijdens het bombardement. Bombarderen de weefsels met behulp van een Particle Gun (in deze methodiek, gebruiken we een eenvoudige en goedkope Particle Instroom Gun 3, PIG, ontworpen in ons laboratorium) als volgt uit: a) de klep die naar de stofzuiger om de kamer te ontruimen, b) open na het vacuüm bereikt 760 mm (30 in) Hg, activeer de solenoïde en laat de helium om de deeltjes te drijven, c) na deeltjesbombardement, sluit het vacuüm lijn kraan en laat het vacuüm met behulp van de uitlaatklep. De helium druk gebruikt om de deeltjes te versnellen is 50 PSI. Nadat het vacuüm wordt vrijgegeven, open de deur naar de kamer gebombardeerd zaadlobben op te halen en tot de terugkeer van de zaadlob, adaxial kant, om OMS kweekmedium. Opmerking: Voor kwantificering en genexpressie, we meestal bombarderen een minimum van drie zaadlobben voor elke DNA-construct. Een positieve controle, wat meestal een DNAconstruct dat geeft een goed bestudeerde gen-expressie profiel, is opgenomen als een referentie. III. Geautomatiseerde Image Collection Zet de kwiklamp en wacht tot 30 minuten voor de lamp is opgewarmd. Schakel de stroom bronnen voor de Spot-RT CCD-camera (Diagnostic Instruments Inc, Sterling Heights, MI, USA) en de robotica platform motor controller, die de beweging van de robotica platform drives. Stel het filter voor GFP-detectie (GFP2 filter in te stellen,.. Ex 480/40 nm, Em 510 LP) op een MZFLIII dissectiemicroscoop (Leica, Heerbrugg, Zwitserland). Steriliseer de verdikte polycarbonaat petrischaal deksels door te besproeien met 70% ethanol. De gespecialiseerde deksels, gebruikt ter dekking van de petrischaal basis condensatie te voorkomen tijdens fotocollectie 4. Plaats de platen met gebombardeerd zaadlobben op de robotica platform (Arrick Robotica, Hurst, TX, USA) van de geautomatiseerde fotocollectie systeem. De robotica platform wordt aangedreven door een stappenmotor set en bestaat uit een tabel voor de bevestiging van 8 petrischalen. Het platform is opgebouwd uit polycarbonaat, polypropyleen en aluminium. Platen zijn bevestigd in positie door het aandraaien van een laterale plastic set-schroef. Open de aangepaste software applicatie die zowel de robotica platform en beeldacquisitie controles. Ook, opent u de software witte licht controller schakelaar. In de "motor motion" tab, klik op "motor" en "motor home". Nadat de software richt het platform om de uitgangspositie, we zijn klaar om te beginnen met het invoeren posities voor elke zaadlob. In de "motor motion" tab, selecteer de eerste plaat. Het platform zal de positie van de midden van de petrischaal onder de doelstelling van de microscoop. Met behulp van de bewegende afstand knoppen, juist positie de eerste zaadlob voor beeld collectie. Met het witte licht controller op, kan het doelgebied worden waargenomen door de computer monitor door het aanzetten van de "live-modus"-functie. Voor de eerste zaadlob, stelt u de focus en vergroting (1,6 x vergroting heeft de voorkeur) met behulp van de handleiding knoppen op het ontleden microscoop. Focus aanpassingen voor de resterende zaadlobben op dezelfde plaat worden gemaakt met behulp van drie nivelleerschroeven zich onder elk bord, op de robotica platform. Zodra het gebied van belang is ingesteld, klikt u op de "add deze positie" te klikken. De software voegt de coördinaten van deze regio naar een positie schema bestand en het platform zal terugkeren naar het midden van de plaat. Stel posities en focus voor alle resterende zaadlobben op de borden met de bewegende afstand knoppen en handmatige nivelleerschroeven. Na alle coördinaten van alle de zaadlobben zijn ingevoerd, slaat u de positie schema coördinaten. Voer de fotocollectie parameters. In het "beeld instelling" tab, selecteer het type licht gewenst, wit of blauw. Voor GFP detectie, alleen het blauwe licht worden gebruikt. Ook voert u de belichtingsinstelling. Hoewel we kunnen de tijd van de blootstelling onafhankelijk van rode, blauwe en groene kleur te wijzigen, wij gebruiken meestal dezelfde instellingen voor het GFP foto-documentatie (20, 14 en 14 seconden voor rood, groen en blauw kanalen, respectievelijk) waardoor we om directe en consistente vergelijking tussen de verschillende DNA-constructen. In dezelfde "beeldinstelling" tab, geef een lege map waarin de afbeeldingen worden opgeslagen. Elke serie beelden worden opgeslagen in deze hoofdmap in onafhankelijke mappen, genummerd opeenvolgend volgens de volgorde van de posities ingeschreven voor zaadlobben. Ga naar de "capture time control" tab en stel het beeld overname tijdsinterval en het totale aantal cycli van het beeld collectie. Beelden worden meestal verzameld elk uur voor 100 uur, het genereren van goed gedefinieerde genexpressie profielen. Begin beeldacquisitie door te klikken op de "run schema!" knop in het "positie schema" tabblad. Aan het einde van de 100 h afbeelding verzameling, overdracht al de beelden van de computer regelen van de robot op een grote capaciteit harde schijf of computer voor verdere beeldanalyse. Beelden met hoge resolutie (1600 x 1200 pixels) worden verzameld als TIF-bestanden te meten ~ 5 Mb per stuk. IV. Beeldanalyse Monteer de 100 opeenvolgende beelden van elke map met behulp van Adobe ImageReady. Open ImageReady en importeer al de opeenvolgende beelden samenstellen van een reeks als frames. Resize originele foto's op 800 x 600 pixels. Verzamelde beelden zijn hoge resolutie, die grote bestanden die kan maken beeldverwerking langzaam genereert. Blader door de beelden en zoek een plek (s) zichtbaar in de meeste afbeeldingen. Zoom tot 300% op de geselecteerde plek (s). Uitlijning van beelden met behulp van een hogere vergroting zorgt voor een nauwkeuriger registratie. Plaats een laag op de top van alle beelden en zorg ervoor dat is zichtbaar in alle frames. Markeer de plek (s) locatie met behulp van de "penseel" tool. Beginnen met de aanpassing alle frames met de "move" tool en het nemen van de markeringen op de laag als een referentie. Als voltooiing van de aanpassing is, verwijdert de laag gebruikt als een referentie en afbeeldingen opslaan als een enkele "psd" bestand. Ook export alle frames als een enkele "mov" bestand met de hoogste resolutie. Handmatige uitlijning van elk beeld series duurt ~ 10 minuten. Voer kwantificering van genexpressie met behulp van ImageJ. Open ImageJ software en open de "mov" bestand dat is opgeslagen eerder in ImageReady. Met behulp van de te selecteren gereedschap, kies een 400 x 300 pixels gebied en de afbeelding bijsnijden. Dit nieuwe bestand moet worden opgeslagen als een "avi" bestand. Scheiden de opeenvolgende beelden, gelegen in het nieuwe "avi" bestand in de rode, blauwe en groene kanalen door te klikken op "beeld", "kleur" en "RGB split" in ImageJ. Trek de achtergrond fluorescentie van alle afbeeldingen in de groene en rode kanalen. Met behulp van het groene kanaal fotoserie, selecteert u een 20 x 20 pixels gebied van een regio met niet-expressie brengen en op te nemen de ligging in de "ROI Manager" tool, zodat het hetzelfde gebied worden geselecteerd in beide kanalen. Met de 20 x 20 pixels vierkant actief in de groene kanaal, ga naar de "plugins" commando in de taakbalk van ImageJ en klik vervolgens op de "trek gemeten ROI voor elk segment" plugin-tool. In ImageJ, klik dan op "Image", "aanpassen" en dan "drempel" te definiëren of het segment van de GFP expressie pixels. Pas de drempel niveaus door het slepen van de bar in de drempel venster om een ​​gemiddelde puntgrootte van 20-30 pixels te verkrijgen. Bepaal GFP expressie met behulp van een plugin die we ontworpen voor het meten van de gemiddelde grijswaarde per pixel en het totale aantal van GFP-expressie pixels. Kopieer de gemiddelde uitvoer grijswaarden in ImageJ en plakken in Microsoft Office Excel. Bereken de GFP uitdrukking voor elk kanaal (rood en groen) door vermenigvuldiging van de gemiddelde grijswaarde per pixel door het totale aantal van GFP-expressie pixels voor elk kanaal. De som van meningsuiting waarden voor beide kanalen geeft de GFP expressie. Waarden kunnen worden gebruikt om de gen-expressie profielen te illustreren en maken directe vergelijkingen. Time-laps films kunnen ook worden gegenereerd met behulp van "mov" of "avi" bestanden, die een unieke en duidelijke visualisatie van het gen expressie profiel. V. representatieve resultaten De robot afbeelding verzamelen en analyseren procedure (afb. 1) hier gerapporteerde maakt de aanschaf van een grote hoeveelheid kwantitatieve gegevens over genexpressie in een korte periode. Voor de plant promotor karakterisering het gebruik van de GFP-gen, deze methodiek is niet alleen nuttig om voorbijgaande expressie profielen aan te maken (afb. 2), maar ook om bij te houden in een gedetailleerde manier GFP-expressie in tijdelijk en stabiel getransformeerde plant weefsels 5,6. Korte time-lapse animatie gegenereerd met de verzamelde opeenvolgende beelden zijn een waardevol instrument voor diepgaande analyses van genexpressie na verloop van tijd in plantaardige weefsels. Deze methodologie heeft ook grote applicatie op factoren die rechtstreeks van invloed zijn genexpressie te evalueren. Zo heeft voorbijgaande GFP expressie onder de aanwezigheid van verschillende onderdrukkers van silencing van virale oorsprong met succes bestudeerd met behulp van onze geautomatiseerde imago verzamelen en analyseren van het systeem 7,8. Figuur 1. Beeldanalyse procedure bestaat uit vier stappen. (A) Overname van het beeld-serie met behulp van de robot afbeelding inzamelsysteem, (B) scheiding van beelden in de rode, blauwe en groene kanalen, (C) segmentatie van het uiten van pixels door het aanpassen van de drempelwaarden, en (D) het verkrijgen van de uitgang resultaten met de grijswaarden en het GFP-expressie richten tellen. Figuur 2. Grafiek verschillende transiënte expressie profielen gedreven door plant promotors gefuseerd met GFP. De gegevens werden verzameld met behulp van onze robot imago opvangsysteem en geanalyseerd met ImageReady en ImageJ software.