Первичные культуры и плазмиды электропорации мышей органа Корти.

День 1. Стерилизация и покрытием из стекла покровные. Сухой стерилизовать покровные стекла микроскопа в автоклаве. Место стерилизовать покровные на две лунки предварительно стерилизованные четыре блюда и культуры клеток. Пальто покровные с 1:01 поли-L-орнитин и ламинин дополнена с 20% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) в течение ночи при температуре 4 ° C. 400 мкл поли-L-орнитин (0,01% раствор хранить при температуре 4 ° С) 400 мкл ламинин (50 мкг / мл маточного раствора, хранящихся в аликвоты при -20 ° С) 200 мкл ФБС (хранится в аликвоты при -20 ° С) Тепло-стерилизовать инструменты рассечение на ночь в 150 ° С инкубатор. Сделать культуральной среде, содержащей 10% сыворотки и 10 мг / мл ампициллина. 90 мл Дульбеко изменения Eagle среднего 5 мл ФБС (хранится в аликвоты при -20 ° С) 5 мл лошадиной сыворотки (хранится в аликвоты при -20 ° С) 10 мкл ампициллин (10 мг / мл маточного раствора хранить при температуре 4 ° С) День 2. Выделение кортиева органа. Стерилизовать положительные капот рассечение потока. Включение УФ-светом в течение 20 минут спрей всех поверхностей с 70% этанола и подождать 5 минут перед использованием. Обезглавьте мыши щенка (P4) у основания большого затылочного отверстия использовании операционных ножницами. Коротко промойте голову в 10 см блюдо, содержащие 70% этанола. Удаление эпидермиса с помощью скальпеля лезвия. Открытое черепа вдоль стреловидного шва использованием лезвие скальпеля, а затем делятся пополам переднего мозга. Сохраните хвостового переднего мозга для дальнейшего вскрытия. Удаление переднего мозга, мозжечка и ствола мозга использовании тупого рассечения. Удалить височных костей (рис. 2А), погрузите их кратко в 70% этанола, и передавать их на 3 мм блюдо со стерильной HBSS. Использование щипцов, удалить булла и окружающие ткани из каменистой части височной кости. Найдите форму раковины улитки (рис. 2B) и отделить его от вестибулярной системы с помощью щипцов. На данном этапе развития, костного лабиринта не полностью кальцинированная и легко расчлененным использованием щипцов. Удалить из костного лабиринта улитки тщательного разделения, начиная с конца базальных и перемещение вершиной использованием щипцов. Связки спираль и придает кортиева органа спиральный по спирали Modiolus (рис. 2С). Осторожно снимите органа Корти, обеспечивая спиральной связки на крючок области базы с использованием щипцов и раскручивание его по мере продвижения к вершине. Начиная с основания, удалить спираль связки из органа Корти с помощью # 55 тонких щипцов (рис. 2D). Микро-изоляции органа Корти сенсорного эпителия (опционально). Удалить орган Корти крюк области базы с использованием двух ½ Шприцы с инсулином вв постоянно прикреплены U-100 28G ½ иглы, как щипцами. Начиная с вершиной, удалить спираль лимба от ряда внутренних волосковых клеток и приступить основанию (рис. 2E-F). Покрытие орган Корти эксплантов Удалить poly-L-ornithine/laminin/FBS решение от культуры скважин и добавить 130 мкл культуральной среды. Передача расчлененный орган Корти для покрытия покровного стекла в культуре хорошо, и ориентироваться эксплантов, так что реснички волосковые клетки вверх. Удалить среды в культуре и использовании 200 мкл пипетки. Убедитесь, что базилярная мембрана производит солидное контакт с покрытием покровного стекла. Аккуратно добавить 130 мкл питательной среды для органа Корти использованием 200 мл пипетки. Применяют две капли на поверхности органа Корти, а затем постепенно добавить оставшийся объем в сторону покровное. Убедитесь, что орган Корти не плавать в культуральной среде, но остается прикрепленной к покровным. Инкубируйте течение ночи при 37 ° С в присутствии 5% СО 2. День 3. Электропорации репортер ген в культивируемые кортиева органа. Удалить культуральной среды от органов культуры Корти. Добавить 130 мкл H 2 O в течение 1 мин, а затем удаляются с помощью 200 мкл пипетки. Добавить 30 мкл DsRed репортера плазмиды (2 мг / мл H 2 O хранить при температуре -20 ° С). Advance электродов electroporator использованием микроманипулятора так что анодго катода по обе стороны от культуры. Генерация импульсов (27В, 30 мс, 10 импульсов), чтобы electroporate репортер гена в органе Корти культуры эксплантов. Дополнительно: обратная полярности импульсов для обеспечения электропорации трансгенов на обоих modiolar и спиральные связки стороны эксплантов. Подождите 5 минут. Добавить 130 мкл Fugene 6: раствор ДНК (3 части Fugene до 2 ДНК части). Это решение должно быть подготовлены до начала электропорации процедура (шаг 20) с использованием 3 мл круглым дном полистирола пробирке в ламинарном боксе. Для того, чтобы это решение: Добавить 2,4 мкл Opti-MEM (хранить при 4 ° С) в пробирке. Добавить 0,6 мкл Fugene 6 реагента (хранить при 4 ° С) в пробирке. Убедитесь в том, чтобы добавить Fugene непосредственно к Opti-MEM и избегать прямого контакта со сторонами пробирке. Vortex в течение 1 секунды. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре. Добавить 2,0 мкл DsRed репортера плазмиды двухцепочечной ДНК (хранить при температуре -20 ° C при 100 ДНК мкг / мл H 2 O аликвоты). Vortex в течение 1 секунды. Инкубировать 15 мин при комнатной температуре. Добавить 200 мкл культуральной среды. Vortex в течение 1 секунды. Выдержите в течение ночи при 37 ° С в 5% СО 2. Добавьте 2 мл питательной среды для культуры и инкубировать в течение 37 ° C в течение 10 дней. Представитель Результаты Мы представляем метод изоляции органа Корти из перинатального мыши. Процедура может быть использована для мышей в возрасте 16-й день эмбрионального примерно до 6-й день послеродового, после чего костного лабиринта становится достаточно кальцинированная оказать рассечение громоздким. После кортиева органа рассеченные, это может быть покрытием и культивировали либо в полном объеме (рис. 3) или в виде микро-изолированных сенсорного эпителия (рис. 4). У нас есть дальнейшие представил технику, чтобы выразить экзогенных генов в культурной кортиева органа. Органотипической культура полезна для многих других видов обучения, такие как анализ орган Корти экспрессии генов использованием RT-PCR или гибридизация, орган Корти со-культуры со спиральными ганглиозных клеток или экзогенных стволовых клеток использованием микро-изоляции 3, или в пробирке анализ волос клеточной смерти и возрождения. Рисунок 1. Поперечное сечение P4 мышиной кортиева органа. (А) сечением от базальный оборот улитки cryosectioned получена из P4 мыши иллюстрирует общую структуру мышиной улитки, описанных в данном протоколе. Скала СМИ граничит с связки спирали и полоска сосудистой боков, мембраны Рейснера а главно, спираль лимба медиально и книзу базальной мембраны. Поле указано регионе расширилась в B. (В) органа Корти расположена на верхней стороне базальной мембраны и включает в себя один ряд внутренних волосковых клеток, в три ряда внешних волосковых клеток, а также их опорных клеток. Пунктирная линия 1 показывает расположение вдоль базилярной мембраны, которая снимается в этот орган рассечение Корти. Пунктирная линия 2 показывает расположение вдоль базилярной мембраны, которая удаляется при микро-выделения. Зеленый цвет означает, иммуногистохимического маркировки кальбиндин, что этикетки межзубных клетки спирального лимба, кохлеарные волосковые клетки, нейроны спирального ганглия, а также клетки связки спирали и полоска сосудистой 7. DAPI маркировка ядер в синий цвет. Рисунок 2. Орган рассечение Корти. Изображения из сопровождающих видео орган выделить рассечение Корти) улитки и вестибулярного аппарата расположены в изолированных височной кости (красный цвет), В) из костного лабиринта улитки, С) связки спирали и прилагается кортиева органа после удаления костного лабиринта, D) удаление спираль связки и полоски сосудистой (красный) из органа Корти, Е), микро-изоляции чувствительного эпителия из спирального лимба (красный), и F) изолированной спиральной лимба (слева) и сенсорного эпителия (справа). Рисунок 3. Искусственный орган Корти эксплантов. DIC изображение, показывающее органКорти из P4 Atoh1-nGFP мышь, которая была изолирована, с гальваническим и культивировали в течение пяти дней, как описано. Эта мышь была генетически модифицированных таким образом, что клетки, которые экспрессируют про-волосковых клеток гена гомолога атональной 1 (Atoh1 ака Math1) имеют зеленый флуоресцентный белок, который локализуется в ядре 8. Органы Корти из этих мышей выставку ядерной этикетке GFP во всех ядрах клеток волос и, следовательно, позволяют легко визуализировать сенсорного эпителия использованием epifluorescent микроскопом. Относительно большая спиральная лимба можно увидеть сбоку от сенсорного эпителия. Мезенхимальные клетки, которые произошли из органа Корти мигрировали от эксплантов. Синяя метка ядерной DAPI. Рисунок 4. Микро-изолированных сенсорного эпителия. Epifluorescent изображение, полученное с сенсорного эпителия, которые были изолированы от P4 мышиной органа Корти, как описано и культивировали в течение ночи. Микро-изолят затем фиксировали в 4% параформальдегида и обрабатываемых в immunolabeling миозина 7а, какие метки кохлеарные волосковые клетки. Обратите внимание на отсутствие сравнительно большие спиральные лимба из рисунка 3. Синяя метка ядерной DAPI. Рисунок 5. Электропорации DsRed гена-репортера в культурной кортиева органа. Всего органами Корти с С-4 Atoh1-nGFP щенков мыши были изолированы, с гальваническим, а затем электропорации с DsRed гена-репортера, как описано, а затем рассматривается под микроскопом epifluorescent. Клетки органа Корти эксплантов, что выражается трансгенных белков DsRed репортер выставку красной флуоресценции и эндогенные клетки эпителия сенсорных выставки зеленого ядерной флуоресценции. Трансгенные клетки можно увидеть во всем спираль лимба и сенсорного эпителия.