Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

Dia 1. Esterilização e revestimento de lamínulas de vidro. Seca esterilizar lamínulas de vidro para microscópio em autoclave. Coloque o lamínulas esterilizadas em dois poços de uma pré-esterilizados placa de cultura de células de quatro bem. Brasão com as lamelas 01:01 poli-L-ornitina e laminina suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS) durante a noite a 4 ° C. 400 mL poli-L-ornitina (solução de 0,01% armazenadas a 4 ° C) 400 laminina mL (50 mg / mL solução estoque armazenado em alíquotas a -20 ° C) FBS 200 mL (armazenada em alíquotas a -20 ° C) Heat-esterilizar as ferramentas de dissecção durante a noite em um 150 ° C incubadora. Tornar o meio de cultura contendo soro de 10% e 10 mg / mL ampicilina. Modificado em 90 mL Dulbecco Eagle Medium 5 mL FBS (armazenada em alíquotas a -20 ° C) 5 mL soro de cavalo (armazenada em alíquotas a -20 ° C) 10 mL ampicilina (10 mg / mL solução estoque armazenado a 4 ° C) Dia 2. Isolamento do órgão de Corti. Esterilizar o capô dissecção positiva de fluxo. ligar a luz UV por 20 min spray de todas as superfícies com álcool 70% e esperar 5 min antes do uso. Decapitar filhote de rato (P4) na base do forame usando uma tesoura operacional. Brevemente lavar a cabeça em 10 centímetros prato contendo etanol 70%. Retirar a epiderme usando uma lâmina de bisturi. Abrir o crânio ao longo da sutura sagital utilizando uma lâmina de bisturi e depois bisect parte frontal do cérebro. Manter o cérebro anterior caudal para dissecção ainda mais. Remover o prosencéfalo, cerebelo e tronco cerebral usando dissecção romba. Retire os ossos temporais (fig. 2A), mergulhá-los brevemente em etanol 70%, e transferi-los para um prato de 3 milímetros contendo HBSS estéril. Utilizando uma pinça, remova a bula e no tecido circundante a partir da porção petrosa do osso temporal. Localize a cóclea em forma de concha (fig. 2B) e separá-lo do sistema vestibular com a pinça. Nesta fase de desenvolvimento, o labirinto ósseo não está completamente calcificada e é facilmente dissecados usando uma pinça. Remover o labirinto ósseo da cóclea pela separação cuidado a partir do final basal e movendo-se no plano apical de fórceps. O ligamento espiral e de órgãos ligados de Corti é enrolada ao longo da espiral do modíolo (fig. 2C). Remova cuidadosamente o órgão de Corti, protegendo o ligamento espiral na região gancho da base usando uma pinça e descontrair-lo como você se move apicalmente. Começando na base, remover o ligamento espiral a partir do órgão de Corti usando uma pinça fina # 55 (fig. 2D). Micro-isolamento do órgão de Corti epitélio sensorial (Opcional). Remover o órgão de Corti região gancho da base com duas seringas de insulina ½ cc com permanentemente ligado U-100 28G ½ agulhas como fórceps. Começando no ápice, remova o do limbo espiral da fileira de células ciliadas internas e proceder basally (fig. 2E-F). Chapeamento o órgão de Corti explante Remover a solução poly-L-ornithine/laminin/FBS dos poços cultura e adicionar 130 mL de meio de cultura. Transferir o órgão de Corti dissecados para a lamela de vidro revestido na cultura bem e orientar o explante, para que os cílios das células ciliadas estão apontando para cima. Remova a mídia na cultura bem com uma pipeta de 200 mL. Certifique-se que a membrana basilar faz com que o contato contínuo com as lamelas de vidro revestido. Juntar cuidadosamente 130 mL de meio de cultura para o órgão de Corti usando uma pipeta 200 mL. Aplicar duas gotas sobre a superfície do órgão de Corti e, em seguida, adicionar lentamente o volume restante para o lado da lamela. Certifique-se que o órgão de Corti não flutuam no meio de cultura, mas permanece afixada à lamela. Incubar durante a 37 ° C na presença de 5% de CO 2. Dia 3. Eletroporação do gene repórter em órgão de cultura de Corti. Remova o meio de cultura do órgão de cultura Corti. Adicionar 130 mL H 2 O, durante 1 minuto e depois retire com uma pipeta de 200 mL. Adicionar 30 mL de repórter DsRed plasmídeo (2 mg / mL H 2 O armazenadas a -20 ° C). Avançar os eletrodos do electroporator usando um micromanipulador de modo que o anodo umcatódicos são nd de ambos os lados da cultura. Gerar um pulso (27V, 30 ms de duração, 10 trens de pulso) para electroporate o gene repórter para o órgão de Corti cultura explante. Opcional: inverter a polaridade do pulso para garantir a eletroporação do transgene em ambos os lados e modiolar o ligamento espiral do explante. Aguarde 5 min. Adicionar 130 mL da Fugene 6: DNA solução (3 a 2 partes Fugene DNA partes). Esta solução deve ser preparada antes do início do procedimento de eletroporação (passo 20) usando um 3 mL de fundo redondo tubo de ensaio de poliestireno em uma capela de fluxo laminar. Para tornar esta solução: Adicionar 2,4 mL de Opti-MEM (armazenado a 4 ° C) para o tubo de ensaio. Adicionar 0,6 mL de reagente Fugene 6 (armazenadas a 4 ° C) para o tubo de ensaio. Certifique-se de adicionar o Fugene diretamente para o Opti-MEM e evitar o contato direto com os lados do tubo de ensaio. Vortex durante 1 segundo. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. Adicionar 2,0 mL DsRed repórter do DNA plasmídeo encalhado (armazenadas a -20 ° C a 100 DNA mcg / mL H 2 O alíquotas). Vortex durante 1 segundo. Incubar 15 min à temperatura ambiente. Adicionar 200 mL de meio de cultura. Vortex durante 1 segundo. Incubar durante a 37 ° C em 5% de CO 2. Adicione 2 mL de meio de cultura a cultura bem e incubar 37 ° C por até 10 dias. Resultados representante Nós apresentamos um método para o isolamento do órgão de Corti de um camundongo perinatal. O procedimento pode ser usado para ratos jovens como dia embrionário 16 até cerca de seis dias pós-parto, altura em que o labirinto ósseo se torna suficientemente calcificadas para tornar a dissecção pesado. Uma vez que o órgão de Corti é dissecado, pode ser folheado e cultivadas tanto em sua totalidade (fig. 3) ou como micro-isolado epitélio sensorial (fig. 4). Temos ainda apresentada uma técnica para expressar genes exógenos no órgão de Corti cultivadas. A cultura organotípicas é útil para muitos outros tipos de estudo, tais como a análise do órgão de Corti de expressão gênica utilizando RT-PCR ou hibridização in situ, órgão de Corti co-cultura com células ganglionares espiral ou células-tronco exógenas utilizando a isolar micro- 3, ou análise in vitro de morte celular e regeneração do cabelo. Figura 1. Seção transversal do órgão P4 murino de Corti. (A) A seção transversal da espira basal da cóclea um cryosectioned obtido a partir de um rato P4 ilustra as estruturas gerais da cóclea murino descrito neste protocolo. A mídia scala faz fronteira com o ligamento espiral e estria vascular lateralmente, a membrana de Reissner s superiormente, a espiral limbo medialmente, ea membrana basilar inferiormente. A caixa indicada a região expandida em B. (B) O órgão de Corti está localizado no lado superior da membrana basilar e inclui uma linha de células ciliadas internas, três fileiras de células ciliadas externas, e suas respectivas células de suporte. Uma linha tracejada indica a localização ao longo da membrana basilar que é removido durante este órgão de dissecção Corti. A linha tracejada 2 indica a localização ao longo da membrana basilar que é removida durante o processo de micro-isolamento. Verde indica imunohistoquímica de calbindina, que rotula as células interdentais do limbo espiral, células ciliadas da cóclea, os neurônios do gânglio espiral, assim como células do ligamento espiral e estria vascular 7. DAPI rotulagem dos núcleos é em azul. Figura 2. Órgão de Corti dissecção. Imagens do vídeo que acompanha do órgão de Corti destacar dissecção A) o sistema de cóclea e vestibular localizado dentro do osso temporais isolados (vermelho), B) do labirinto ósseo da cóclea, C) o ligamento espiral e anexado órgão de Corti após a remoção do labirinto ósseo, D) a remoção do ligamento espiral e estria vascular (vermelho) do órgão de Corti, E) micro-isolamento do epitélio sensorial do limbo espiral (vermelho) e F), o isolado do limbo espiral (esquerda) e epitélio sensorial (direita). Figura 3. Órgão de Corti cultivadas explante imagem. DIC mostrando o órgão deCorti de um rato P4 Atoh1-nGFP que foi isolado, chapeado, e cultivadas por cinco dias, conforme descrito. Este rato tem sido geneticamente modificados para que as células que expressam o gene de células pró-cabelo homólogo atonal 1 (aka Atoh1 Math1) exibem uma proteína verde fluorescente que está localizado ao núcleo 8. Os órgãos de Corti destes ratos exibem uma etiqueta GFP nuclear em todos os núcleos das células ciliadas e, portanto, permitir a fácil visualização do epitélio sensorial usando um microscópio de epifluorescência. A relativamente grande do limbo espiral pode ser vista lateral ao epitélio sensorial. Células mesenquimais, que se originaram do órgão de Corti migraram longe do explante. Rótulo azul é nuclear DAPI. Figura 4. Micro-isolado epitélio sensorial. Epifluorescência imagem obtida a partir do epitélio sensorial que foi isolado de um órgão P4 murino de Corti como descritas e cultivadas durante a noite. O micro-isolado foi então fixado em paraformaldeído 4% e processados ​​para imunomarcação de Miosina 7 rótulos que as células ciliadas da cóclea. Observe a ausência da comparativamente maior do limbo espiral a partir da figura 3. Rótulo azul é nuclear DAPI. Figura 5. Eletroporação de gene repórter DsRed no órgão de Corti cultivadas. Órgãos inteiros de Corti de filhotes P4 Atoh1-nGFP rato foram isolados, banhados, e depois electroporated com o gene repórter DsRed como descrito e, em seguida, visto sob um microscópio de epifluorescência. Células do órgão de Corti explante que expressa a proteína transgênica repórter DsRed células exibem uma fluorescência vermelha e endógenos da exposição epitélio sensorial uma fluorescência verde nuclear. Células transgénicas pode ser visto em todo o limbo espiral e epitélio sensorial.