Culture primaire et l'électroporation plasmidique de l'Organe de Corti murin.

Jour 1. Stérilisation et du revêtement des lamelles de verre. Dry stériliser les lamelles de microscope en verre dans un autoclave. Placez les lamelles stérilisés dans deux puits d'une pré-stérilisés de quatre puits boîte de culture cellulaire. Enduire les lamelles avec 1:1 poly-L-ornithine et de laminine complété avec 20% sérum de veau fœtal (SVF) pendant la nuit à 4 ° C. 400 ul de poly-L-ornithine (solution à 0,01% conservés à 4 ° C) 400 uL laminine (50 pg / ml de solution concentrée conservée en aliquots à -20 ° C) 200 uL de FBS (stockées en aliquots à -20 ° C) Heat-stériliser les outils de dissection nuit dans un incubateur à 150 ° C. Faire un milieu de culture contenant du sérum de 10% et 10 mg / ml d'ampicilline. 90 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium 5 ml de FBS (stockées en aliquots à -20 ° C) 5 ml de sérum de cheval (stockées en aliquots à -20 ° C) 10 uL ampicilline (10 mg / ml solution stock entreposé à 4 ° C) Jour 2. L'isolement de l'organe de Corti. Stériliser la hotte à flux positifs de dissection. allumez la lumière UV pendant 20 min pulvériser toutes les surfaces avec de l'éthanol 70% et attendre 5 minutes avant utilisation. Décapitez souris chiot (P4) à la base du foramen magnum avec des ciseaux d'exploitation. Rincer brièvement la tête de 10 cm contenant plat éthanol à 70%. Enlever l'épiderme à l'aide d'un scalpel. Ouvrez la boîte crânienne le long de la suture sagittale en utilisant une lame de scalpel puis coupent le prosencéphale. Conservez le prosencéphale caudale pour la dissection plus loin. Retirez le prosencéphale, le cervelet et le tronc cérébral à l'aide dissection. Retirer l'os temporal (figure 2A), les tremper brièvement dans de l'éthanol à 70%, et les transférer sur un plat de 3 mm contenant HBSS stérile. En utilisant des pinces, enlever la bulle et les tissus environnants de la partie pétreuse de l'os temporal. Localisez la conque cochlée en forme (figure 2B) et le séparer du système vestibulaire à l'aide des pinces. A ce stade du développement, le labyrinthe osseux n'est pas complètement calcifiée et est facilement disséquée par forceps. Retirez le labyrinthe osseux de la cochlée par une séparation minutieuse à partir de l'extrémité basale et déménagement apicalement l'aide de pinces. Le ligament spiral et l'organe de Corti est attachée lové le long de la spirale de la columelle (figure 2C). Retirer délicatement l'organe de Corti en sécurisant le ligament spiral au crochet de la région de la base de l'aide de pinces et dénouement que vous vous déplacez vers l'apex. À partir de la base, enlever le ligament spiral de l'organe de Corti en utilisant # 55 pinces fines (figure 2d). Micro-isolement de l'organe de Corti épithélium sensoriel (facultatif). Retirez le crochet de l'organe de la région de Corti de la base en utilisant deux seringues à insuline ½ cc avec attaché en permanence U-100 28G ½ aiguilles comme une pince. À partir de l'apex, retirez le limbe spirale de la rangée de cellules ciliées internes et procéder basale (figure 2E-F). Placage l'organe de Corti explant Retirer la solution poly-L-ornithine/laminin/FBS du puits de culture et d'ajouter 130 ul de milieu de culture. Transfert de l'organe de Corti disséqué la lamelle de verre recouvert de la culture et d'orienter ainsi l'explant de sorte que les cils des cellules ciliées sont pointant vers le haut. Retirez le support de la culture bien en utilisant une pipette 200 ul. Assurez-vous que la membrane basilaire en contact solide avec la lamelle de verre enduit. Ajouter avec précaution 130 uL de milieu de culture à l'organe de Corti à l'aide d'une pipette de 200 ml. Appliquer deux gouttes sur la surface de l'organe de Corti, puis ajouter lentement le volume restant sur le côté de la lamelle. Assurez-vous que l'organe de Corti ne flottent pas dans les milieux de culture, mais elle reste fixée à la lamelle. Incuber une nuit à 37 ° C, en présence de 5% de CO 2. Jour 3. L'électroporation du gène rapporteur dans les organes de culture de Corti. Retirez le milieu de culture de l'orgue de la culture Corti. Ajouter 130 uL H 2 O pendant 1 min puis retirez à l'aide d'une pipette 200 ul. Ajouter 30 uL d'un journaliste DsRed plasmide (2mg / ml H 2 O conservés à -20 ° C). Advance les électrodes de l'aide d'un micromanipulateur électroporateur sorte que l'anode unecathodiques e sont de chaque côté de la culture. Générer une impulsion (27V, 30 ms, 10 trains d'impulsions) pour électroporer le gène rapporteur dans l'organe de Corti explant culture. En option: inverser la polarité de l'impulsion pour assurer l'électroporation du transgène sur les deux côtés et modiolar ligament spiral de l'explant. Attendre 5 min. Ajouter 130 uL de la Fugene 6: solution d'ADN (3 parties à 2 Fugene ADN parties). Cette solution doit être préparée avant le début de la procédure d'électroporation (étape 20) en utilisant un 3 ml à fond rond en polystyrène de test tube dans une hotte à flux laminaire. Pour rendre cette solution: Ajouter 2,4 ul d'Opti-MEM (conservés à 4 ° C) pour le tube à essai. Ajouter 0,6 ul de Fugene 6 réactif (conservés à 4 ° C) pour le tube à essai. Assurez-vous d'ajouter le Fugene directement à l'Opti-MEM et éviter le contact direct avec les parois du tube d'essai. Vortex pendant 1 seconde. Incuber 5 min à température ambiante. Ajouter 2,0 uL journaliste DsRed plasmide ADN double brin (conservés à -20 ° C à 100 ug d'ADN / ml de H 2 O aliquotes). Vortex pendant 1 seconde. Incuber 15 min à température ambiante. Ajouter 200 ul de milieu de culture. Vortex pendant 1 seconde. Incuber une nuit à 37 ° C dans 5% de CO 2. Ajouter 2 ml milieu de culture à la culture puits et incuber pendant 37 ° C pendant jusqu'à 10 jours. Les résultats représentatifs Nous présentons une méthode pour l'isolement de l'organe de Corti d'une souris périnatale. La procédure peut être utilisée pour les souris aussi jeunes que 16 jours embryonnaire jusqu'à environ 6 jours après la naissance, à quel point le labyrinthe osseux devient suffisamment calcifiés pour rendre la dissection encombrant. Une fois l'organe de Corti est disséqué, il peut être plaqué et cultivés soit dans sa totalité (figure 3) ou que la micro-isolées épithélium sensoriel (figure 4). Nous avons encore présenté une technique pour exprimer des gènes exogènes dans l'organe de Corti cultivés. La culture organotypique est utile pour de nombreux autres types d'études, tels que l'analyse de l'organe d'expression du gène Corti par RT-PCR ou l'hybridation in situ, organe de Corti de co-culture avec des cellules du ganglion spiral ou de cellules souches exogènes utilisant l'isolat de micro- 3, ou l'analyse in vitro de la mort cellulaire des cheveux et de régénération. Figure 1. Coupe transversale de l'organe de P4 murin de Corti. (A) Une section transversale de la tour basal de la cochlée cryosectioned obtenu à partir d'une souris P4 illustre les structures générales de la cochlée murin décrit dans ce protocole. Les médias Scala est bordée par le ligament spiral et la strie vasculaire latéralement, la membrane de la Reissner s supérieurement, la spirale limbe médial, et la membrane basilaire bas. La boîte indique la région élargie dans B. (B) L'organe de Corti est située sur la face supérieure de la membrane basilaire et comprend une rangée de cellules ciliées internes, trois rangées de cellules ciliées externes, et leurs cellules de soutien. La ligne pointillée 1 indique l'emplacement le long de la membrane basilaire qui est enlevé au cours de la dissection de cet organe Corti. La ligne pointillée 2 indique l'emplacement le long de la membrane basilaire qui est éliminé lors de la procédure de micro-isolement. La couleur verte indique marquage immunohistochimique des calbindine, dont les étiquettes des cellules du limbe interdentaire spirale, les cellules ciliées cochléaires, les neurones du ganglion spiral, ainsi que les cellules du ligament en spirale et vasculaire 7 strie. DAPI étiquetage des noyaux en bleu. Figure 2. Orgue de dissection Corti. Images de la vidéo qui l'accompagne de l'organe de Corti en évidence une dissection A) le système vestibulaire cochlée et situé dans l'os isolés temporel (rouge), B) le labyrinthe osseux de la cochlée, C), le ligament spiral et attaché organe de Corti après le retrait du labyrinthe osseux, D) la suppression du ligament en spirale et strie vasculaire (rouge) de l'organe de Corti, E) des micro-isolement de l'épithélium sensoriel du limbe spirale (rouge), et F) du isolées spirale limbe (à gauche) et l'épithélium sensoriel (à droite). Figure 3. L'organe de Corti de culture des explants. DIC images montrant l'organe deCorti sur un P4-Atoh1 nGFP souris qui a été isolé, plaqué, et cultivés pendant cinq jours, comme décrit. Cette souris a été génétiquement modifié afin que les cellules qui expriment le gène de cellules pro-poils homologue Atonal 1 (alias Atoh1 Math1) présentent une protéine fluorescente verte qui est localisée dans le noyau 8. Les organes de Corti de ces souris présentent une étiquette GFP nucléaire dans tous les noyaux des cellules de cheveux et donc permettre une visualisation facile de l'épithélium sensoriel en utilisant un microscope à épifluorescence. La spirale relativement grand limbe peut être vu latéraux à l'épithélium sensoriel. Les cellules mésenchymateuses qui proviennent de l'organe de Corti ont migré loin de l'explant. Blue Label nucléaire est DAPI. Figure 4. Micro-isolé épithélium sensoriel. Épifluorescence l'image obtenue à partir de l'épithélium sensoriel qui a été isolé à partir d'un P4 organe de Corti murin tel que décrit et mis en culture pendant la nuit. Le micro-isoler a ensuite été fixés dans du paraformaldéhyde 4% et traitées pour immunomarquage de 7a myosine qui étiquettes cellules ciliées cochléaires. Notez l'absence de la spirale comparativement plus limbe de la figure 3. Blue Label nucléaire est DAPI. Figure 5. Electroporation de gène rapporteur DsRed dans l'organe de Corti cultivés. Organes entiers de Corti de chiots P4 souris Atoh1-nGFP ont été isolés, plaqué, puis électroporation avec le gène rapporteur DsRed tel que décrit et observe ensuite sous un microscope à épifluorescence. Les cellules de l'organe de Corti explant qui ont exprimé la protéine rapporteur DsRed transgéniques présentent une fluorescence rouge des cellules endogènes et de l'exposition épithélium sensoriel une fluorescence verte nucléaire. Cellules transgéniques peuvent être vus tout au long du limbe en spirale et l'épithélium sensoriel.