الابتدائية الثقافة وElectroporation البلازميد الجهاز الفئران كورتي.
概要
يصف هذا الإجراء وسيلة لعزل والثقافة الجهاز الفئران كورتي مع أو بدون حوف ودوامة لولبية العقدة العصبية. نظهر أيضا طريقة للتعبير عن الجينات مراسل الخارجية في جهاز ازدراع كورتي بواسطة electroporation.
Abstract
في جميع الثدييات ، ويقع ظهارة حسية عن الاختبار على طول الجهاز المتصاعد كورتي التي تتواجد داخل القوقعة في شكل محارة الأذن الداخلية (أنظر الشكل 1). يتم محاذاة خلايا الشعر في القوقعة النامية ، والتي هي الخلايا mechanosensory النظام السمعي ، في صف واحد من خلايا الشعر الداخلي وثلاثة (في منتصف القاعدة ويتحول) إلى أربعة (في مطلع القمي) صفوف من خلايا الشعر الخارجي التي تمتد على طول جهاز كورتي. خلايا الشعر تنبيغ الصوت الناجم عن الاهتزازات الميكانيكية في الغشاء القاعدي في النبضات العصبية التي يمكن للدماغ تفسيرها. هي سبب معظم حالات فقدان السمع الحسي عليها بالإعدام أو خلل في خلايا الشعر القوقعة.
أداة أساسية على نحو متزايد في مجال البحوث السمعي هو العزلة والثقافة في المختبر لازدراع الجهاز 1،2،9 مرة واحدة معزولة ، يمكن الاستفادة من explants في عدة طرق لتوفير المعلومات المتعلقة المعيارية ، شاذة ، أو علم وظائف الأعضاء العلاجية. التعبير الجيني ، حركية أهداب ساكنة ، الخلية والبيولوجيا الجزيئية ، وكذلك النهج البيولوجية لتجديد خلايا الشعر هي أمثلة على التطبيقات التجريبية للجهاز explants كورتي.
يصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل وثقافة جهاز كورتي من الفئران حديثي الولادة. شريط الفيديو المرافق تشمل الاتجاهات متدرج للعزلة العظم الصدغي من الجراء الماوس ، والعزلة لاحقة من القوقعة ، الرباط لولبية ، وجهاز كورتي. مرة واحدة معزولة ، ويمكن مطلي ظهارة حسية وتربيتها في المختبر في مجمله ، أو في شكل تشريح أخرى. عزل الصغيرة التي تفتقر إلى حوف ودوامة لولبية العقدة العصبية باستخدام هذه الطريقة ، يمكن الحفاظ على explants الأولية لمدة 7-10 أيام. كمثال على فائدة هذا الإجراء ، سيتم electroporated جهاز explants كورتي مع الجين مراسل DsRed الخارجية. هذا الأسلوب يوفر تحسنا اكثر من غيرها من أساليب المنشورة لأنها توفر توجيهات يمكن استنساخه ، لا لبس فيها ، ومتدرج للعزلة ، microdissection والثقافة الأساسي للجهاز كورتي.
Protocol
Discussion
هناك العديد من التفاصيل التي تعتبر حاسمة بالنسبة لنجاح هذا الإجراء. وأقصر وقت من العزلة العظم الصدغي للجهاز حضانة كورتي ، زادت فرصة أن الأجهزة سوف نعلق على ساترة ، ويؤدي في الثقافات الجهاز قابلة للحياة. لذا ، فمن المهم للحد من مقدار الوقت بين التشريح ووضع الأجهزة في الحاضنة. اختيار المضادات الحيوية أمر حاسم أيضا ، لأن المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد كثيرة السامة ، وسوف يؤدي إلى موت الخلايا الشعر. على الرغم من أنه من الأفضل التخلي عن استخدام المضادات الحيوية تماما ، وهذا يترك الباب مفتوحا أمام إمكانية للتلوث. لذا ، نقترح استخدام 10 ميكروغرام / مل الأمبيسيلين كقاعدة عامة للتغلب على مشاكل التلوث المحتملة.
الجانب الأكثر إزعاجا من ذلك ، وغيرها من الإجراءات لثقافة الرئيسي للهيئة في كورتي ، والميل للأجهزة لتطفو قبالة لوحات أثناء الحضانة. على الرغم من الثقافات الجهاز عائمة يمكن أن تبقى صالحة لمدة 5-7 أيام ، وهناك عيوب أجهزة زراعة العائمة. على سبيل المثال ، والثقافات الجهاز العائمة أضعاف في كثير من الأحيان على أنفسهم بعد 4-5 أيام تقديم المجهري للمشاكل. بعد ذلك ، يمكن أن تصبح خطر على السلامة الهيكلية للجهاز بالمقارنة مع الأجهزة التي تم اضافته الى ساترة. لقد وجدنا أن تساعد الطرق التالية للتأكد من أن جهاز كورتي لا تطفو في وسائل الإعلام والثقافة ، لكنها لا تزال الملصقة على ساترة. أولا ، ومعطف الزجاج coverslips في polyornithine 1:1 / laminin تستكمل مع FBS 20 ٪ كما هو موضح. وبين عشية وضحاها حضانة دعا في هذا البروتوكول هو الحد الأدنى من الوقت الذي يجب أن تطلى اللوحة. في المختبر لدينا ، فإننا كثيرا ما معطف جميع لوحات أننا في حاجة لمدة اسبوع والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية حتى قبل يوم ونحن لاستخدامه عند نقلها إلى حاضنة لتفريخ بين عشية وضحاها. الثانية ، بعد أن يتم نقلها إلى أجهزة coverslips المغلفة ، وتوجيه يزدرع بحيث أهداب من خلايا الشعر مواجهة. وهذا التوجه تسهيل انضمام الغشاء القاعدي للصحن الثقافة. ثالثا ، إزالة وسائل الإعلام داخل البئر ليضعوا على لازدراع الطبق المطلي. وهذا ضمان الاتصال بين الطبق والثقافة ، والغشاء القاعدي وتعزيز قدرة explants التمسك الزجاج. هذا سوف يساعد أيضا في الحفاظ على السلامة الهيكلية للصفوف من خلايا الشعر. أخيرا ، بالتنقيط بعناية 2 قطرات من الثقافة المتوسطة على سطح الجهاز كورتي باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ثم ملء ببطء البئر بواسطة نازف حجم المتبقية (من مجموع 130 ميكرولتر) على جانب من ساترة. من المهم أن نعمل بسرعة لضمان الحجز على الجهاز كورتي إلى ساترة المغلفة. من الشروع في تشريح لحضانة explants ، فإنه عادة ما يستغرق 10 دقائق لمشغل يمارس لإكمال هذا الجهاز الداخلي العزلة كورتي.
في هذا البروتوكول ، نقدم أيضا وسيلة لعزل الجزئي للظهارة حسية من حوف دوامة جهاز كورتي. في هذا الإجراء ، يتم تشريح حوف دوامة بعيدا عن ظهارة حسية باستخدام إبر الأنسولين 28G ½ كأدوات تشريح. ويتكون الناتج الدقيقة عزل للصفوف من خلايا الشعر ويناظرها الخلايا الداعمة (الشكل 3). ويمكن عندئذ للظهارة حسية تكون معزولة مثقف كما هو موضح في هذا البروتوكول. وينبغي مقارنة هذا الإجراء العزل الجزئي للفصل الأنزيمية للظهائر الحسية من الأنسجة المحيطة 4. في الثدييات ، فضلا عن الأنواع غير الثدييات مثل الدجاج ، والهضم thermolysin معزولة النتائج الأجهزة الدهليزي في عزلة ظهائر الحسية من خلايا اللحمة المتوسطة قبو 4. في القوقعة الفئران ، ونتائج عملية الهضم thermolysin في فصل الحرف أكبر الظهارية ، والحرف أقل الظهارية ظهائر الحسية المصاحبة من الغشاء القاعدي 5. ومع ذلك ، فإنه من غير الواضح ما إذا كانت قوقعة ظهارة حسية يمكن أن نعلق على لوحات مغلفة دون خلايا اللحمة المتوسطة المصاحبة. في حين أن كلا الميكانيكية الدقيقة العزلة الأسلوب والطريقة الأنزيمية نتيجة الهضم في فصل ظهائر الحسية من دوامة حوف ، مزايا التشريح الدقيقة عزل على الهضم thermolysin تشمل بروتوكول أقصر نسبيا ، وأرخص المواد الكاشفة ، والتوتر المحتمل أن تكون أقل ونتيجة للتأثيرات يزدرع الأنزيمية للهضم. بالإضافة إلى ذلك ، يتم ترك سليمة الغشاء القاعدي في هذا النهج ، الذي قد يؤدي إلى تعزيز مرفق للظهارة حسية إلى لوحة الثقافة. مساوئ هذا الأسلوب تشمل الحاجة لتطوير المهارات اللازمة لهذا التشريح الدقيق والأضرار الميكانيكية المحتملة للظهارة حسية الناتجة عن التشريح الجزئي.
كمثال على فائدة هذا الإجراء ، ونحن أيضا تقديم مثال واحد على استخدام جهازكورتي الثقافات ، وelectroporation جينات دخيلة في ثقافة ازدراع. ويستند هذا الإجراء electroporation المذكورة أعلاه على الطرق السابقة من جهاز electroporation كورتي. على وجه الخصوص ، وتشنغ قاو (2000) وصفا لelectroporation الأجهزة الفئران المعزولة كورتي حيث يحتجز في مكان لexplants electroporation بواسطة أخدود مصبوب من agarose ومطلي ثم على الكولاجين المغلفة الشريحة LabTek 8 جيدا في المصل خالية المتوسطة 2. ميزة هذا النهج هو أنه موجهة الأجهزة بحيث السطوح أعلى explants مواجهة القطب السالب ، والتي ينبغي أن يؤدي نظريا في التوزيع حتى من الخلايا electroporated عبر ازدراع. في أيدينا إلا أن الطريقة التي وصفنا تحسن على هذا الإجراء لأن الجهاز كورتي بقيت الملصقة على ساترة في جميع أنحاء الداخلي مما يحد من التلاعب في يزدرع بعد electroporation. بالإضافة إلى ذلك ، لا تزال تعلق نسبة أعلى من أجهزة كورتي إلى coverslips باستخدام هذه الطريقة المعروضة. يؤخذ من أسلوبنا جونز ، وآخرون (2006) والذي يستخدم إضافة كاشف 6 Fugene لزيادة كفاءة في التعبير الجيني بعد electroporation. في بروتوكول جونز وآخرون (2006) ، وelectroporated أجهزة والمحتضنة لمدة 5 دقائق مع 100 ميكرولتر من كاشف Fugene ترنسفكأيشن 6 ، و 6 مطلي. أسلوبنا يختلف في استخدام نسبة 3:02 من 6 كاشف Fugene لبلازميد الحمض النووي ، الذي وجدناه تجريبيا لتوفير وراثيا التعبير الأمثل مع سمية الجهاز الأدنى. نحن لا نستخدم مخفف Fugene 6 كاشف ، التي يمكن أن تؤدي إلى تسمم في الثقافات. التكوين الكهربائي في بروتوكول لدينا ، فضلا عن جونز وآخرون (2006) ، والنتائج الأولية في التعبير الجيني في دوامة إما حوف ظهارة حسية أو تبعا للموقف الكاثود. على الرغم من أن هناك خلايا DsRed ايجابية على الجانب من الثقافة بعيدة إلى القطب السالب ، وهناك تركيز أعلى من الخلايا المعدلة وراثيا أقرب إلى الكاثود. لضمان التعبير الكامل للالتحوير في كلا الجانبين من جهاز ازدراع كورتي ، يمكن عكس التيار لقطار نبضة الثانية يقود عكس ببساطة. النتائج الواردة في بروتوكول تعبير قوي من التحوير في جميع أنحاء جهاز كورتي (الشكل 5).
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر Demêmes دانييل وCotanche دوغلاس ولما بذلوه من جهود في مجال التدريس لنا الطرق لعزل الجهاز كورتي. بالإضافة إلى ذلك ، نود أن نشكر إسماعيل ستيفانوف – فاغنر للهندسة الأقطاب electroporator ؛ شيري لين عن أعمالها الفنية التي تسهم في الرسوم المتحركة الفيديو ، ومتى شانا ، ميكر جيسون ، وكندرا مارشال ( www.goodfightproductions.com ) لإنتاج الفيديو. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منح (R03DC010065 – باركر ؛ RO1DC007174 الحافة ؛ P30DC05209 MEEI النواة لدعم أبحاث السمع) من NIDCD.
Materials
| Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glass microscope coverslips | DYNALAB Corporation (Rochester, NY) | 2010 | 10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce | |
| 4 ringed cell culture dish | Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 627170 | Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO) | P4957 | 0.01% Solution | |
| Laminin | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) | 354232 | made in mouse | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 26140-095 | Qualified | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | RS-6806 | Straight, sharp-blunt length 5″ | |
| #11 Scalpel Blade | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 372611 | ||
| #4 Dumoxel forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11241-30 | ||
| #55 Dumostar fine forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11295-51 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 10564-011 | High Glucose | |
| Horse Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 2605088 | Heat Inactivated | |
| Ampicillin Sodium Salt | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11593-027 | Irradiated | |
| ½ cc Lo-Dose Insulin Syringe | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 329465 | U-100 28G½ | |
| Fugene 6 Transfection Reagent | Roche (Mannheim, Germany) | 11-815-091-001 | ||
| Polystyrene test tube | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 14-956-5A | ||
| Laminar flow hood | The Baker Company (Stanford, ME) | Model SG603a | SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet |
|
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985 | ||
| Reporter plasmid | Clontech (Mountain View, CA) | 632539 | pCMV DsRed-Express 2 | |
| Electroporator | BioRad (Hercules, CA) | 165–2662 | BioRad Gene Pulser Xcell |
参考文献
- Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. Organotypic Development of the Organ of Corti in Culture. Journal of Neurocytology. 119 (4), 543-543 (1975).
- Zheng, J. L., Gao, W. Q. Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears. Nature Neuroscience. 3 (6), 580-580 (2000).
- Martinez-Monedero, R. THE POTENTIAL ROLE OF ENDOGENOUS STEM CELLS IN REGENERATION OF THE INNER EAR. J Neurobiol. 66 (4), 319-319 (2006).
- Saffer, L. D., Gu, R., Corwin, J. T. An RT-PCR analysis of mRNA for growth factor receptors in damaged and control sensory epithelia of rat utricles. Hearing Research. 94 (1,2), 14-14 (1996).
- Zhang, Y. Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 271-271 (2007).
- Jones, J. M. Inhibitors of Differentiation and DNA Binding (Ids) Regulate Math1 and Hair Cell Formation during the Development of the Organ of Corti. J. Neurosci. 26 (2), 550-550 (2006).
- Daniela, B., Josef, S. Calbindin and S100 protein expression in the developing inner ear in mice. The Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 469-469 (2009).
- Helms, A. W. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127 (6), 1185-1185 (2000).
- Zheng, J. L., Wei-Qiang, G. Differential Damage to Auditory Neurons and Hair Cells by Ototoxins and Neuroprotection by Specific Neurotrophins in Rat Cochlear Organotypic Cultures. European Journal of Neuroscience. 8 (9), 1897-1897 (1996).
