Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.
Tüm memeliler, seçmelere için duyu epiteli, iç kulak (Şekil 1) kabuklu şeklinde koklea içinde bulunduğu spiral şeklindeki organ Corti boyunca yer almaktadır. Işitme sistemi mechanosensory hücreleri gelişmekte olan koklea, saç hücreleri tek bir satır ve iç saç hücreleri üç (temel ve orta-dönüşleri) dört (apikal sırayla) dış saç hücrelerinin satır hizalanır Corti organı süresini kapsar. Saç hücreleri, beyin yorumlayabilir sinirsel uyarılara çeviren baziler membran ses kaynaklı mekanik titreşimler transduce. Sensorinöral işitme kaybı vakalarının çoğu koklear saçlı hücreler ölüm veya işlev bozukluğundan kaynaklanır.
Işitsel araştırma, giderek daha temel bir araç izolasyon ve organ eksplant 1,2,9 in vitro kültürü . Izole sonra, eksplantlar bilgilere ilişkin normatif, anormal, ya da terapötik fizyolojisi sağlamak için çeşitli şekillerde kullanılabilir. Gen ifadesi, stereocilia motilite, hücre ve moleküler biyoloji, yanı sıra saç hücre rejenerasyonu için biyolojik yaklaşımlar Corti eksplantlar organ deneysel uygulamaların örnekleridir.
Bu protokol, yenidoğan farelerin Corti organı izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. İlişikteki video fare yavrular temporal kemik izolasyonu için adım adım talimatlar ve koklea, spiral ligament ve Corti organı sonraki izolasyon içerir. Bir kez izole edilmiş, duyusal epitel kaplama ve bütünüyle in vitro olarak kültüre, ya da bir başka disseke spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar yoksun olduğu mikro-izole eder . edilebilir Bu yöntemi kullanarak, birincil eksplantlar 7-10 gün süreyle muhafaza edilebilir. Bu prosedürün yardımcı programı bir örnek olarak, Corti eksplantlar organı dışsal DsRed muhabiri gen electroporated olacaktır. Izolasyon, mikrodiseksiyon ve Corti organı primer kültür, tekrarlanabilir, net, ve adım adım yönergeleri sağlar, çünkü bu yöntem yayınlanan diğer yöntemleri üzerinde bir iyileşme sağlar.
Bu prosedürün başarısı için kritik olan pek çok ayrıntı vardır. Temporal kemik izolasyon Corti inkübasyon, organları canlı organ kültürlerinde lamel ve sonuç eklemek edeceği büyük şansı organ için kısa zaman. Bu nedenle, diseksiyon ve organları inkübatör yerleştirerek arasındaki süreyi sınırlamak için önemlidir. Antibiyotik seçimi, birçok aminoglikozid antibiyotikler ototoksik ve saç hücre ölümüne neden olacağından da çok önemlidir. Antibiyotik kullanımı tamamen vazgeçmek için tercih edilse de, bu kirlenme olasılığını açık bırakıyor. Bu nedenle, potansiyel kirlenme sorunların üstesinden gelmek için genel bir kural olarak 10 mikrogram / ml ampisilin kullanmanızı öneririz.
Bu en sıkıntılı yönü ve diğer prosedürler Corti organı temel kültür, inkübasyon sırasında plakaları float organlarının eğilimidir. Kayan organ kültürleri, 5-7 gün boyunca canlı kalır rağmen, kültür yüzen organların sakıncaları vardır. Örneğin, mikroskopi sorunlu hale 4-5 gün sonra genellikle kendileri üzerine kat yüzen organ kültürleri. Daha sonra, lamel yapıştırılmış olan organlara kıyasla organın yapısal bütünlüğünü tehlikeye düşer. Corti organı kültür ortamı float olmadığından emin olmak için aşağıdaki teknikleri yardımcı olduğunu bulduk, ancak lamel yapıştırılmış kalır. Birincisi, 01:01 polyornithine / laminin kat cam lamelleri olarak açıklanan% 20 FBS ile desteklenmiştir. Bu protokol adı verilen gecede inkübasyon plaka kaplı olması gerektiği minimum süredir. Laboratuvarımızda, sık sık kat biz bir hafta boyunca ihtiyaç ve 4 tutmak plakaların ° C güne kadar biz onları bir gecede inkübasyon için inkübatör taşıdığınızda kullanımdan önce. İkincisi, organlar saç hücrelerinin silya bakacak şekilde yönlendirmek, kaplamalı lamelleri eksplant taşınır sonra. Bu yönelim, kültür çanak baziler membran bağlılık kolaylaştıracaktır. Üçüncü olarak, eksplant kaplı çanak yapıştırmayın kuyu içinde medya kaldırmak. Bu kültür çanağı ve baziler membran arasında temas sağlamak ve cama yapışır eksplantlar yeteneğini artıracaktır. Bu aynı zamanda saç hücrelerinin satır yapısal bütünlüğünü korumak yardımcı olacaktır. Son olarak, dikkatli bir şekilde yüzeye 200 mcL kapasitesi pipet kullanarak Corti organı kültür ortamı 2 damla damla ve daha sonra yavaş yavaş lamel tarafında kalan hacim (toplam 130 mcL) damlayan tarafından iyi doldurun. Corti organı kaplı lamel eki sağlamak için hızlı bir şekilde çalışmak için çok önemlidir. Eksplantlar kuluçka diseksiyon başlangıcından itibaren, genellikle uygulanan bir operatör için bu organ Corti izolasyon prosedürü tamamlamak için 10 dakika sürer.
Bu protokol, biz de spiral Corti organı limbustan duyu epiteli mikro-izolasyonu için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemde, spiral limbus 28G kullanarak duyu epitel gaita ½ diseksiyon araçları olarak insülin iğneleri. Mikro-izole saç hücreleri ve bunlara karşılık gelen destekleyen hücrelerin (Şekil 3) satırları oluşur. Bu protokol açıklandığı gibi izole duyu epitel sonra yetiştirilebilir. Bu mikro-izolasyon prosedürü duyu epitel doku 4 çevreleyen enzimatik ayırma karşılaştırılmalıdır. Gibi tavuk, bodrum mezenkimal hücreler 4 duyu epitel izolasyon izole vestibüler organları thermolysin sindirim gibi memelilerin yanı sıra, non-memeli. Rat koklea, büyük epitel sırt ayrılması, daha az epitel sırt ve eşlik eden duyusal epitelde bazal membran 5 thermolysin sindirim sonuçları. Ancak, koklear duyu epitel beraberindeki mezenkimal hücreler olmadan kaplı plakalar ekleyebilirsiniz belirsizdir. Mekanik mikro-izolasyon yöntemi ve enzimatik sindirim yöntemi spiral limbustan duyu epitel ayrılması sonucu, thermolysin sindirim üzerinde mikro-izole diseksiyon avantajları hem de nispeten daha kısa bir protokol, ucuz reaktifler ve potansiyel olarak daha az stres sindirim enzimatik etkileri nedeniyle eksplant. Ayrıca, bazal membran kültür plaka duyu epitel eki artırabilir, bu yaklaşım sağlam bırakılır. Bu yöntemin dezavantajları bu hassas diseksiyon ve duyu epiteli mikro diseksiyon kaynaklanan potansiyel mekanik hasar becerilerini geliştirmek için ihtiyaç içerir.
Bu prosedürün yardımcı programı bir örnek olarak, biz de organ kullanımının bir örnek sunmakCorti kültürleri; eksplant kültür ekzojen genlerin elektroporasyon. Corti elektroporasyon organ önceki yöntem, yukarıda açıklanan elektroporasyon prosedürü dayanır. Özellikle, Zheng ve Gao (2000) eksplantlar elektroporasyon için agaroz bir kalıp oluk tarafından yerinde tutulur ve daha sonra kolajen serum orta 2 kaplamalı 8-iyi LABTEK slayt kaplama Corti izole sıçan organlarının elektroporasyon açıklar. Kendi yaklaşımının bir avantajı organları eksplantlar üst yüzeyleri teorik eksplant üzerinde electroporated hücreleri düzgün bir dağıtım sonuçlanması gerekiyor katot, yüz böylece odaklı. Corti organı böylece elektroporasyon sonra eksplant manipülasyon azaltarak işlem boyunca lamel yapıştırılmış kaldı, çünkü bizim elimizde ise, tarif yöntemi bu yordamı geliştirilmiş. Ayrıca, Corti organların daha yüksek bir yüzdesi sunulan bu yöntemi kullanarak lamelleri bağlı kaldı. Bizim yöntemi Jones ve ark (2006) Fugene 6 reaktif elektroporasyon sonra gen ekspresyonu verimliliğini artırmak için ek kullanır alınır. Jones ve arkadaşları (2006) protokolü, organları, electroporated Fugene 6 transfeksiyon reaktif mcL 100 ve 6 kaplama ile 5 dakika inkübe. Bizim yöntem Fugene 6 reaktif bir 3:2 oranı minimum organ toksisitesi ile optimal transgenik ifade sağlamak için deneysel olarak bulundu. Plazmid DNA kullanımı farklıdır. Kültürlere toksisite neden olabilir, sulandırılmamış Fugene 6 reaktif kullanmayın. Bizim protokol elektrod yapılandırma yanı sıra spiral limbus veya katot pozisyonuna bağlı olarak duyu epitel birincil gen ekspresyonu Jones ve arkadaşları (2006), sonuçlar. Katot uzak kültürünün yan DsRed pozitif hücreler olmasına rağmen, katot yakın transgenik hücrelerin daha yüksek bir konsantrasyonu vardır. Transgen eksplant Corti organı her iki tarafında tam bir ifade sağlamak için, mevcut yol açar sadece tersini ikinci bir darbe tren ters olabilir. Corti organı (Şekil 5) boyunca transgen sağlam ifade sunulan protokol sonuçları.
Yazarlar Demêmes Danielle ve Douglas Cotanche teşekkür etmek ve bize Corti organı izolasyonu için öğretim yöntemleri çabaları için. Sherry Lin video animasyon onu katkıda sanat için; ve Matthew Chana Jason Meeker ve Kendra Marshall (Ayrıca, Elektroporatör elektrotlar mühendislik Stefanov-Wagner İsmail'in teşekkür etmek istiyorum www.goodfightproductions.com ) video üretimi için. Bu çalışma NIDCD hibeler (İşitme Araştırma P30DC05209-MEEI Çekirdek Desteği; RO1DC007174-Kenar R03DC010065-Parker) tarafından finanse edildi.
Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Glass microscope coverslips | DYNALAB Corporation (Rochester, NY) | 2010 | 10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce | |
4 ringed cell culture dish | Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 627170 | Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO) | P4957 | 0.01% Solution | |
Laminin | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) | 354232 | made in mouse | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 26140-095 | Qualified | |
Operating scissors | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | RS-6806 | Straight, sharp-blunt length 5″ | |
#11 Scalpel Blade | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 372611 | ||
#4 Dumoxel forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11241-30 | ||
#55 Dumostar fine forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11295-51 | ||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 10564-011 | High Glucose | |
Horse Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 2605088 | Heat Inactivated | |
Ampicillin Sodium Salt | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11593-027 | Irradiated | |
½ cc Lo-Dose Insulin Syringe | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 329465 | U-100 28G½ | |
Fugene 6 Transfection Reagent | Roche (Mannheim, Germany) | 11-815-091-001 | ||
Polystyrene test tube | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 14-956-5A | ||
Laminar flow hood | The Baker Company (Stanford, ME) | Model SG603a | SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet |
|
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985 | ||
Reporter plasmid | Clontech (Mountain View, CA) | 632539 | pCMV DsRed-Express 2 | |
Electroporator | BioRad (Hercules, CA) | 165–2662 | BioRad Gene Pulser Xcell |