이 절차 또는 나선 limbus 및 나선 신경절의 뉴런없이 Corti의 murine 기관의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 electroporation에 의해 Corti explant의 기관에서 외인성 리포터 유전자의 표현 방법을 보여줍니다.
모든 포유 동물에서 오디션에 대한 감각 상피는 내이 (内耳) (그림 1)의 콘치 모양의 달팽이관 내에있는 Corti의 나선형 기관을 따라 위치하고 있습니다. 청각 시스템의 mechanosensory 세포의 개발 달팽이관,의 세포는 하나 내부 세포의 행 세 (기본 중반 전환)을 네 가지 (혀끝의 차례로) 외부 세포의 행에 정렬됩니다 그 Corti의 기관의 길이에 걸쳐. 세포는 두뇌가 해석할 수있는 신경 자극으로 두개골 기저부의 막의 사운드 유도된 기계적 진동을 transduce. 감각 청각 손실의 대부분은 달팽이 세포의 사망이나 장애로 인해 발생합니다.
청각 연구에 점점 더 필수적인 도구가 고립되고 장기 explant 1,2,9의 체외 문화 인치 일단 격리, explants는 정보에 관한 규범, 변칙, 또는 치료 생리를 제공하기 위해 여러 가지 방법으로 활용 수 있습니다. 유전자 발현, stereocilia의 운동성, 세포 및 분자 생물학뿐만 아니라 머리 세포 재생을위한 생물 학적 접근 Corti의 explants의 기관의 실험 응용 프로그램의 예입니다.
이 프로토콜은 신생아 생쥐에서 Corti의 기관의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 함께 비디오 마우스 새끼에서 측두 골의 격리를 위해 stepwise 방향과 달팽이관, 나선 인대, 그리고 Corti의 기관의 후속 고립을 포함합니다. 일단 고립, 감각 상피는 도금과 전체 체외에서 교양, 또는 추가로 해부 나선 limbus하고 나선 신경절의 뉴런이 부족되는 마이크로 – 분리. 수 있습니다 이 방법을 사용하여 기본 explants은 70~10일에 대한 유지하실 수 있습니다. 이 절차의 유틸리티의 예를 들어, Corti의 explants의 기관은 외인성 DsRed 리포터 유전자로 electroporated 것입니다. 그것은 고립, microdissection, 그리고 Corti의 기관의 주요 문화, 재현성 모호하지 않은, 그리고 stepwise 방향을 제공하기 때문에이 방법은 다른 방법을 통해 출판 향상을 제공합니다.
이 절차의 성공을 위해 중요한 몇 가지 세부 사항이 있습니다. 측두 골의 절연에서 Corti 보육, 장기 이식 문화의 coverslip 및 결과에 연결할 수있는 큰 기회의 기관에 짧은 시간. 따라서, 해부 및 보육에 장기 배치 사이의 시간의 양을 제한하는 것이 중요합니다. 많은 aminoglycoside의 항생제가 ototoxic하고 헤어 세포 죽음을 초래하기 때문에 항생제의 선택도 중요합니다. 그것이 모두 항생제의 사용을 …없이 지내다 것이 바람직하지만, 이것은 오염에 대한 가능성을 엽니다 떠납니다. 따라서, 우리는 잠재적인 오염 문제를 극복하기 위해 일반적으로 10 μg / ML 암피실린의 사용을 권장합니다.
이 대부분의 성가신 측면, 그리고 Corti의 기관의 기본 문화에 대한 다른 절차가 부화하는 동안 접시를 부동으로 장기 경향이있다. 부동 장기 문화가 5~7일 결혼은 남아있을 수 있지만, culturing 부동 장기의 단점이있다. 예를 들어, 현미경은 문제가 렌더링 4-5일 후 자신에 자주 배 부동 기관 문화. coverslip에 부착된되었습니다 장기에 비해 이후, 장기의 구조적 무결성이 손상 될 수 있습니다. 우리는 다음과 같은 기술이 Corti의 기관은 문화 미디어 부동하지 않도록하는 데 도움이 발견했지만 coverslip에 부착된 남아 있습니다. 첫째, 1시 1분 polyornithine / laminin에 코팅 유리 coverslips는 설명 20% FBS와 함께 보충. 이 프로토콜에 대한라고 하룻밤 배양은 접시를 코팅해야한다는 최소한의 시간입니다. 저희 연구실에서는, 우리는 종종 우리는 코트 1 주일에 필요한 4에서 그들을 유지하는 것이 접시의 모든 ° 우리가 하룻밤 배양을위한 인큐베이터로 이동할 때 C는 날까지 전에 사용할 수 있습니다. 세포의 속눈썹가 얼굴 있도록 둘째, 장기 방향은, 코팅 coverslips에 explant를 이송 후. 이 오리 엔테이션은 문화 접시에 두개골 기저부의 막의 부착을 용이하게합니다. 셋째, explant의 코팅 접시에 부착하기 위해 잘 내에서 미디어를 제거합니다. 이것은 문화 요리와 두개골 기저부의 멤브레인 사이의 접촉을 보장하고 유리에 준수하는 explants의 능력을 향상시킬 것입니다. 이것은 세포의 행 구조적 무결성을 유지하는 도움이 될 것입니다. 마지막으로, 신중하게 200 μL 용량 피펫을 사용하여 Corti의 장기의 표면에 배지 2 방울 드립 후 서서히 coverslip의 측면에 남아있는 볼륨 (총 130 μL의) 흘리지하여 잘 입력합니다. 코팅 coverslip에 Corti의 기관의 첨부 파일을 보장하기 위해 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. explants의 부화에 절개의 개시에서 그것은 일반적으로 Corti 격리 절차의 기관을 완료하려면 연습 운영자 10 분 걸립니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 Corti의 기관의 나선 limbus에서 감각 상피의 마이크로 – 절연을위한 방법을 제시한다. 이 절차에서는 나선 limbus는 28G를 사용하여 감각 상피에서 떨어진 해부 있습니다 ½ 인슐린 바늘 해부 도구로. 마이크로 분리를 발생하는 세포 및 해당 지원하는 세포 (그림 3)의 행으로 구성되어 있습니다. 이 프로토콜에서 설명한대로 격리 감각 상피 그때 교양 수 있습니다. 이 마이크로 절연 절차는 조직 4 주변에서 감각 상피 조직의 효소 분리에 비해해야합니다. 예 닭, 지하 mesenchymal 세포 4 감각 상피 조직의 격리 격리된 vestibular 장기 결과의 thermolysin 소화 등 포유류에서뿐만 아니라 비 포유 동물 종. 쥐 달팽이관에서 큰 상피 능선의 분리, 낮은 상피 리지와 지하 막 5 동반 감각 상피 조직의 thermolysin의 소화 결과. 그러나, 그것은 달팽이 감각 상피가 함께 mesenchymal 세포없이 코팅 접시에 첨부할 수 있는지 확실하지 않다. 기계적 마이크로 절연 방식과 나선 limbus에서 감각 상피 조직의 분리 효소 소화 방법 결과, thermolysin의 소화를 통해 마이크로 분리 절개의 장점을 모두 비교적 짧은 프로토콜, 저렴 시약, 그리고 잠재적으로 덜 스트레스를 포함하는 동안 소화 효소의 효과로 인해 explant. 또한, 지하 막는 문화 판에 감각 상피의 첨부 파일을 향상시킬 수있는,이 접근법에 그대로 남아 있습니다. 이 방법의 단점이 섬세한 해부와 마이크로 절개로 인한 감각 상피 잠재적인 기계적 손상에 대한 기술을 개발 할 필요가 있습니다.
이 절차의 유틸리티의 예를 들어, 우리는 또한 기관의 사용 중 한 예를 제시Corti 문화, explant 문화에 외인성 유전자의 electroporation. 위에서 설명한 electroporation 절차는 Corti의 electroporation의 기관의 이전 방법에 따라 달라집니다. 특히, 청 그리고 가오 (2000)은 explants는 아가로 오스의 성형 홈으로 electroporation을 위해 장소에서 개최하고 콜라겐에 대한 혈청이없는 배지 2 코팅 8 잘 LabTek 슬라이드 도금 아르 Corti의 절연 쥐 기관의 electroporation을 설명합니다. 그들의 접근 방식의 장점은 장기가 explants의 상단 표면 이론적 explant 전체 electroporated 세포도 분포가 발생해야하는 음극을 얼굴 있도록 방향이다. Corti의 기관이이를 electroporation 후 explant의 조작을 줄이는 절차 전반에 걸쳐 coverslip에 부착된 남아 있기 때문에 우리의 손에 그러나 우리가 설명하는 방법은이 절차를 개선. 또한, Corti의 장기의 높은 비율이 제시 방법을 사용하여 coverslips에 붙어 있었다. 우리의 방법은 존스, 외. (2006) electroporation 후 유전자 발현의 효율성을 높일 수있는 Fugene 6 시약의 추가를 사용하여에서 가져옵니다. 존스 외. (2006) 프로토콜에서는, 장기는 100 Fugene 6 transfection 시약의 μL, 그리고 도금 6 5 분 incubated, electroporated 있습니다. 우리의 방법은 우리가 최소한의 장기 독성과 최적의 형질 표현을 제공하기 위해 경험적으로 발견 플라스미드 DNA에 Fugene 6 시약의 3시 2분 비율의 사용 다릅니다. 우리는 문화에 독성을 초래할 수있는, undiluted Fugene 6 시약을 사용하지 마십시오. 우리 프로토콜에서 전극 구성뿐만 아니라 나선 limbus 또는 음극의 위치에 따라 감각 상피 중의 기본 유전자 발현의 존스 외. (2006) 결과. 음극에 먼 문화의 측면에 DsRed 긍정적인 세포가 있지만, 가까이 음극으로 유전자 변형 세포의 높은 농도가있다. Corti explant의 기관의 양쪽에있는 transgene의 완전한 표현을 보장하기 위해, 현재 단순히 반전 연결에 의해 두 번째 펄스 열차 되돌릴 수 있습니다. Corti (그림 5)의 장기에 걸쳐 transgene의 강력한 표현의 표시 프로토콜 결과입니다.
저자 Demêmes 다니엘과 더글러스 Cotanche 감사의 마음을 우리에게 Corti의 기관의 격리를 위해 방법을 가르치는 그들의 노력에 대한 것입니다. 비디오 애니메이션 그녀의 공헌 아트웍을 셰리 린,, 그리고 마 차나, 제이슨 메커 및 켄드라 마샬 (또한, 우리는 electroporator 전극 공학 Stefanov – 바그너 이스마엘에게 감사를 표합니다 www.goodfightproductions.com ) 동영상을 제작. NIDCD에서이 작품은 보조금 (연구 청문회 P30DC05209 – MEEI 코어 지원,, RO1DC007174 첨단 R03DC010065 – 파커)에 의해 재정 지원되었다.
Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
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Glass microscope coverslips | DYNALAB Corporation (Rochester, NY) | 2010 | 10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce | |
4 ringed cell culture dish | Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 627170 | Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO) | P4957 | 0.01% Solution | |
Laminin | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) | 354232 | made in mouse | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 26140-095 | Qualified | |
Operating scissors | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | RS-6806 | Straight, sharp-blunt length 5″ | |
#11 Scalpel Blade | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 372611 | ||
#4 Dumoxel forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11241-30 | ||
#55 Dumostar fine forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11295-51 | ||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 10564-011 | High Glucose | |
Horse Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 2605088 | Heat Inactivated | |
Ampicillin Sodium Salt | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11593-027 | Irradiated | |
½ cc Lo-Dose Insulin Syringe | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 329465 | U-100 28G½ | |
Fugene 6 Transfection Reagent | Roche (Mannheim, Germany) | 11-815-091-001 | ||
Polystyrene test tube | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 14-956-5A | ||
Laminar flow hood | The Baker Company (Stanford, ME) | Model SG603a | SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet |
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Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985 | ||
Reporter plasmid | Clontech (Mountain View, CA) | 632539 | pCMV DsRed-Express 2 | |
Electroporator | BioRad (Hercules, CA) | 165–2662 | BioRad Gene Pulser Xcell |