תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

ביום 1. עיקור וציפוי של coverslips זכוכית. יבש לעקר מיקרוסקופ coverslips זכוכית החיטוי. מניחים את coverslips מעוקרים לשתי בארות של מנה טרום מעוקרים ארבע היטב תרבית תאים. המעיל coverslips עם 01:01 poly-L-ornithine ו laminin בתוספת סרום 20% שור עוברית (FBS) לילה ב 4 ° C. 400 μL poly-L-ornithine (פתרון 0.01% המאוחסן ב 4 ° C) 400 laminin μL (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​מניות פתרון מאוחסנים aliquots ב -20 ° C) 200 FBS μL (מאוחסן aliquots ב -20 ° C) חום לעקר את הכלים לנתיחה לילה 150 ° C חממה. בצע בינוני תרבות סרום המכיל 10% ו 10 מ"ג / מ"ל ​​אמפיצילין. 90 מ"ל של Dulbecco השתנה הנשר בינוני 5 מ"ל FBS (מאוחסן aliquots ב -20 ° C) 5 מ"ל סוס בסרום (מאוחסן aliquots ב -20 ° C) 10 אמפיצילין μL (10 מ"ג / מ"ל פתרון מניות מאוחסנים 4 ° C) יום 2. בידוד של האיבר של קורטי. לעקר את מכסה המנוע לנתיחה תזרים חיובי. להדליק את האור UV במשך 20 דקות לרסס את כל המשטחים עם 70% אתנול ו לחכות 5 דקות לפני השימוש. לערוף עכבר גור (P4) בבסיס מגנום foramen באמצעות מספריים ההפעלה. בקצרה לשטוף את הראש בצלחת 10 ס"מ המכיל 70% אתנול. הסר את האפידרמיס בעזרת להב סכין המנתחים. פתח את הגולגולת לאורך תפר sagittal באמצעות להב סכין המנתחים ואז לחצות forebrain. לשמור על forebrain הזנב לניתוח נוסף. הסר את, forebrain המוח הקטן ואת גזע המוח באמצעות דיסקציה קהה. מוציאים את העצמות הטמפורלית (תאנה 2A), לטבול אותם בקצרה אתנול 70%, ולהעבירם צלחת 3 מ"מ המכיל HBSS סטרילית. בעזרת מלקחיים, להסיר את הבולה ואת הרקמה שמסביב מפרשת petrous של העצם הטמפורלית. אתר את שבלול בצורת קונכייה (תאנה 2B) ולהפריד אותו מן המערכת הוסטיבולרית באמצעות מלקחיים. בשלב זה של פיתוח, מבוך גרמי לא מסויד לחלוטין והוא גזור בקלות באמצעות מלקחיים. הסר את המבוך הגרמי של שבלול על ידי הפרדה זהירה החל בסוף הבסיס ומרגש apically באמצעות מלקחיים. רצועה הספירלה ואת איבר צמוד של קורטי הוא מפותל לאורך הספירלה של כישור (איור 2C). הסר בזהירות את האיבר של קורטי על ידי הבטחת רצועה ספירלה בשעה האזור וו הבסיס באמצעות מלקחיים ההתרה זה כאשר אתה מזיז apically. החל בבסיס, להסיר את הרצועה ספירלה מן האיבר של קורטי באמצעות מלקחיים # 55 דק (איור 2 ד). Micro-הבידוד של האיבר של האפיתל קורטי חושית (אופציונאלי). הסר את האיבר האזור וו קורטי הבסיס באמצעות שני מזרקים אינסולין ½ סמ"ק עם U-100 28G מצורף לצמיתות ½ מחטים כמו מלקחיים. החל בפסגת, להסיר את הספירלה לימבוס משורה של תאים שיער הפנימי והמשך basally (תאנה 2E-F). ציפוי האיבר של קורטי explant הסר את הפתרון poly-L-ornithine/laminin/FBS מבארות תרבות ולהוסיף 130 μl של המדיום לתרבות. העברת האיבר של קורטי גזור כדי coverslip הזכוכית מצופה בתרבות היטב המזרח explant כך cilia של תאים שיער מכוונים למעלה. הסר את המדיום בתרבות גם באמצעות פיפטה 200 μL. ודא כי קרום basilar יוצר מגע עם מוצק coverslip הזכוכית מצופה. בזהירות להוסיף 130 μL של המדיום תרבות לאיבר של קורטי בעזרת פיפטה 200 מ"ל. החלת שתי טיפות על פני השטח של האיבר של קורטי ואז לאט לאט להוסיף את נפח הנותרים לצד coverslip. ודא כי האיבר של קורטי לא לצוף בתקשורת תרבות, אבל עדיין מודבקת coverslip. דגירה לילה בשעה 37 ° C בנוכחות CO 5% 2. יום 3. Electroporation של הגן כתב לתוך איבר תרבותי של קורטי. הסר את המדיום תרבות מאיבר של התרבות קורטי. הוספת 130 μL H 2 O דקות 1 ולאחר מכן להסיר בעזרת פיפטה 200 μL. הוסף 30 μL של הכתב DsRed פלסמיד (2mg / מ"ל H 2 O המאוחסן ב -20 ° C). מראש את האלקטרודות של electroporator באמצעות micromanipulator כך האנודהקטודה nd הם משני צדי התרבות. צור דופק (27V, 30 מילישניות משך, 10 רכבות הדופק) כדי electroporate הגן כתב לתוך איבר התרבות explant קורטי. אופציונלי: להפוך את הקוטביות של הדופק כדי להבטיח electroporation של transgene על modiolar וגם רצועה ספירלית צידי explant. המתן 5 דקות. הוספת 130 μL של Fugene 6: פתרון ה-DNA (3 חלקים Fugene ל-DNA חלקי 2). פתרון זה אמור להיות מוכן לפני תחילת ההליך electroporation (שלב 20) באמצעות 3 התחתונה מ"ל עגול פוליסטירן המבחנה במנדף זרימה למינרית. כדי להפוך את הפתרון הזה: הוסף 2.4 μL של Opti-ממ (המאוחסן ב 4 ° C) על המבחנה. הוסף 0.6 μL של מגיב 6 Fugene (המאוחסן ב 4 ° C) על המבחנה. הקפד להוסיף את Fugene ישירות Opti-ממ ולהימנע ממגע ישיר עם צדדים של המבחנה. וורטקס לרגע 1. דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 2.0 μL כתב DsRed פלסמיד DNA גדילי כפול (המאוחסן ב -20 ° C ב-DNA 100 מיקרוגרם / מ"ל H 2 aliquots O). וורטקס לרגע 1. דגירה 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוספת 200 μL של המדיום לתרבות. וורטקס לרגע 1. דגירה לילה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2. הוסף 2 מ"ל בינוני תרבות לתרבות היטב דגירה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד 10 ימים. נציג תוצאות אנו מציגים שיטה הבידוד של האיבר של קורטי מ – עכבר הלידה. ההליך יכול לשמש עכברים צעיר כמו יום עובריים 16 עד יום הלידה על 6, ובנקודה המבוך הגרמי הופך מסויד מספיק כדי להבהיר לנתיחה מסורבלת. לאחר האיבר של קורטי הוא גזור, זה עשוי להיות מצופה תרבותי או בשלמותה (איור 3) או אפיתל מיקרו מבודד חושית (איור 4). הצגנו עוד טכניקה כדי להביע את הגנים אקסוגניים באיבר תרבותי של קורטי. תרבות organotypic שימושית עבור סוגים רבים אחרים של מחקר, כגון ניתוח של איבר קורטי של ביטוי גנים באמצעות RT-PCR או הכלאה באתרו, איבר קורטי שיתוף התרבות תאים עם הגנגליון ספירלה או בתאי גזע ממקור חיצוני באמצעות מיקרו לבודד 3, או בניתוח חוץ גופית מוות שיער תא והתחדשות. באיור 1. הצלב סעיף של האיבר P4 Murine של קורטי. (א) חתך מ להפוך את הבסיס של שבלול cryosectioned המתקבל עכבר P4 ממחיש את מבנה כללי של שבלול Murine המתואר בפרוטוקול זה. התקשורת scala גובל רצועה הלולייניות stria vascularis רוחבית, הממברנה של Reissner superiorly, לימבוס ספירלה מדיאלית, ואת קרום basilar inferiorly. תיבת הצביע על האזור התרחב ב (ב) איבר קורטי ממוקם בצד מעולה של קרום basilar וכולל שורה אחת של תאים השיער הפנימיים, שלוש שורות של תאים השיער החיצונית, והתאים שלהם התומכים. קו מקווקו 1 מציין את מיקומו לאורך הממברנה basilar כי יוסר במהלך איבר זה של דיסקציה קורטי. קו מקווקו 2 מציין את מיקומו לאורך הממברנה basilar כי יוסר במהלך ההליך מיקרו הבידוד. גרין מציין תיוג immunohistochemical של calbindin, אשר תוויות תאים interdental של לימבוס ספירלה, תאים שיער שבלול, הגנגליון נוירונים ספירלה, כמו גם תאים של הרצועה ספירלה stria vascularis 7. תיוג DAPI של גרעיני הוא בכחול. איור 2. איברים של דיסקציה קורטי. תמונות מתוך וידאו המלווה של האיבר של קורטי להדגיש דיסקציה) של מערכת שיווי המשקל ואת השבלול הממוקם בתוך העצם הטמפורלית מבודדים (אדום), ב ') את המבוך הגרמי של שבלול, ג) את הרצועה ספירלה מצורף האיבר של קורטי לאחר הסרת המבוך הגרמי, ד) הסרת רצועה הלולייניות stria vascularis (אדום) של האיבר של קורטי, E) מיקרו הבידוד של האפיתל חושית מן לימבוס ספירלה (אדום), ו-F) מבודדים ספירלה לימבוס (משמאל) אפיתל סנסורי (מימין). איור 3. איבר תרבותי של קורטי explant. DIC התמונה מראה את איברקורטי של עכבר-P4 Atoh1 nGFP כי היה מבודד, מצופה, ותרבותי במשך חמישה ימים, כמתואר. עכבר זה כבר מהונדסים גנטית כך התאים המבטאים את הגן הפרו שיער תא homolog אטונלי 1 (aka Atoh1 Math1) התערוכה חלבון פלואורסצנטי ירוק כי הוא מקומי לגרעין 8. האיברים של קורטי מעכברים אלה תערוכה תווית ה-GFP גרעיני גרעיני כל תא שיער ולכן מאפשרים ראיה קל של האפיתל חושית באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent. הספירלה לימבוס גדול יחסית ניתן לראות לרוחב האפיתל חושית. תאים mesenchymal אשר מקורם האיבר של קורטי היגרו מן explant. התווית גרעיני כחול הוא DAPI. איור 4. Micro-מבודדים אפיתל תחושתי. תמונה Epifluorescent המתקבל האפיתל חושית כי כבר מבודד איבר P4 Murine של קורטי כמתואר ותרבותיים בין לילה. מיקרו לבודד נקבע אז paraformaldehyde 4% ומעובד immunolabeling 7 א שרירן אשר תוויות בתאי השיער בשבלול. הערה העדר הספירלה לימבוס יחסית גדול מן הדמות 3. התווית גרעיני כחול הוא DAPI. איור 5. Electroporation של הגן כתב DsRed לתוך איבר תרבותי של קורטי. איברים שלמים של קורטי מן הגורים P4 Atoh1-nGFP עכבר בודדו, מצופה, ו electroporated אז עם הגן כתב DsRed כמתואר ואחר כך מתחת למיקרוסקופ epifluorescent. תאים של האיבר של קורטי explant כי הביע את חלבון מהונדס כתב DsRed התערוכה תאים פלואורסצנטי אנדוגני אדום התערוכה אפיתל סנסורי פלואורסצנטי ירוק גרעיני. התאים הטרנסגניים ניתן לראות ברחבי לימבוס ספירלה אפיתל תחושתי.