Dieses Verfahren beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der murinen Corti-Organ mit oder ohne die Spirale Limbus und Spiralganglions Neuronen. Wir zeigen auch ein Verfahren zur Expression eines exogenen Reporter-Gen in das Corti-Organ Explantat durch Elektroporation.
In allen Säugetieren ist das Sinnesepithel für Vorsprechen an der Spirale des Corti-Organs, die innerhalb der Muschel geformt Cochlea des Innenohres (Abb. 1) befindet sich befindet. Haarzellen in der Cochlea zu entwickeln, die die mechanosensorischen Zellen des auditorischen Systems sind, sind in einer Reihe von inneren Haarzellen und drei (in der Basis und Mitte dreht) bis vier (in der apikalen turn) Reihen von äußeren Haarzellen ausgerichtet dass span die Länge des Corti-Organ. Haarzellen transduzieren Sound-induzierten mechanischen Schwingungen der Basilarmembran in Nervenimpulse, die das Gehirn interpretiert werden können. Die meisten Fälle von Hörverlust sind durch den Tod oder eine Dysfunktion der Haarzellen der Cochlea verursacht.
Ein zunehmend wichtiges Instrument im auditorischen Forschung ist die Isolierung und in vitro-Kultur der Orgel Explantation 1,2,9. Einmal isoliert, kann die Explantate in mehrere Möglichkeiten, um Informationen über normative, anomale oder therapeutischen Physiologie bieten genutzt werden. Die Genexpression, Stereozilien Motilität, Zell-und Molekularbiologie sowie biologische Ansätze für die Haare Zellregeneration sind Beispiele für experimentelle Anwendungen von Corti-Organ Explantate.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Corti-Organ von neugeborenen Mäusen. Das dazugehörige Video enthält schrittweise Anweisungen für die Isolierung des Felsenbeins aus Maus-Welpen, und anschließender Isolierung der Cochlea, Ligamentum spirale und des Cortischen Organs. Einmal isoliert, kann das sensorische Epithel überzogen und werden in vitro kultiviert in seiner Gesamtheit, oder als eine weitere seziert Mikro-Isolat, das fehlt der Spirale Limbus und Spiralganglions Neuronen. Mit dieser Methode können primäre Explantate für 7-10 Tage aufrechterhalten werden. Als ein Beispiel für die Nützlichkeit dieses Verfahrens wird Corti-Organ Explantate mit einem exogenen DsRed Reportergen elektroporiert werden. Diese Methode stellt eine Verbesserung gegenüber anderen publizierten Methoden, weil sie reproduzierbar, eindeutig und schrittweise Anweisungen für die Isolierung, Mikrodissektion und primären Kultur des Corti-Organ zur Verfügung stellt.
Es gibt mehrere Details, die entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens sind. Je kürzer die Zeit vom Schläfenbein Trennung nach Corti-Organ Inkubationszeit, desto größer ist die Chance, dass die Organe werden dem Deckglas und Ergebnis in tragfähige Organkulturen befestigen. Deshalb ist es wichtig, die Zeitspanne zwischen Präparation und Platzierung der Organe in den Inkubator zu begrenzen. Die Wahl des Antibiotikums ist auch entscheidend, da viele Aminoglycosidantibiotika ototoxischen sind und bleiben im Haar zum Zelltod führen. Obwohl es vorzuziehen ist, den Einsatz von Antibiotika gänzlich zu verzichten, lässt diese die Möglichkeit offen, für Verunreinigungen. Daher empfehlen wir die Verwendung von 10 pg / mL Ampicillin in der Regel auf eine mögliche Kontamination Probleme zu überwinden.
Die am schwierigsten Aspekt dieses und andere Verfahren für die primäre Kultur des Corti-Organ, ist die Tendenz der Organe zu schweben von den Platten während der Inkubation. Obwohl schwimmenden Organkulturen, kann es für 5-7 Tage lebensfähig, es gibt auch Nachteile der Kultivierung schwimmenden Organe. Zum Beispiel, schwimmende Organkulturen oft folden auf sich selbst nach 4-5 Tagen Rendering-Mikroskopie problematisch. Anschließend kann die strukturelle Integrität des Organs beeinträchtigt, wenn die Organe, die dem Deckglas angebracht worden ist verglichen zu werden. Wir haben festgestellt, dass die folgenden Techniken, um sicherzustellen, dass das Corti-Organ nicht in den Kulturmedien float helfen, bleibt aber auf dem Deckglas fixiert. Zunächst beschichten Deckgläschen in 1:1 Polyornithin / Laminin mit 20% FBS, wie beschrieben ergänzt. Die Inkubation über Nacht in diesem Protokoll genannten ist die minimale Zeit, dass die Platte beschichtet werden sollen. In unserem Labor haben wir oft Mantel alle Platten, die wir brauchen für eine Woche und halten sie bei 4 ° C bis zu dem Tag vor dem Gebrauch, wenn wir sie bewegen den Inkubator für eine Inkubation über Nacht. Zweitens, nachdem die Organe sind, um die beschichteten Deckgläsern transportiert, orient dem Explantat, so dass die Zilien der Haarzellen bis Gesicht. Diese Orientierung erleichtern die Einhaltung der Basilarmembran der Kulturschale. Drittens, entfernen Sie die Medien in der auch das Anbringen der Explantation zu den beschichteten Gericht. Dadurch wird sichergestellt, den Kontakt zwischen der Kulturschale und der Basilarmembran und verbessern die Fähigkeit der Explantate auf dem Glas haften. Dies wird auch bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Reihen von Haarzellen zu unterstützen. Schließlich sorgfältig abtropfen 2 Tropfen Kulturmedium auf die Oberfläche des Corti-Organ mit einer 200 ul Kapazität Pipette und dann langsam füllen Sie das auch von tropfenden das restliche Volumen (der insgesamt 130 ul) auf der Seite des Deckglases. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten, um die Befestigung des Corti-Organ auf der beschichteten Deckglas zu gewährleisten. Von der Einleitung der Dissektion der Inkubation der Explantate, es dauert normalerweise 10 Minuten für einen geübten Bediener dieses Organ von Corti Trennung abzuschließen.
In diesem Protokoll, stellen wir auch ein Verfahren zur Mikro-Isolierung der Sinnesepithel aus der Spirale Limbus des Corti-Organ. In diesem Verfahren wird die Spirale Limbus vom Sinnesepithel mit 28G seziert ½ Insulin Nadeln Dissektion Werkzeuge. Die daraus resultierenden Mikro-Isolat besteht aus den Reihen der Haarzellen und die entsprechenden Stützzellen (Abb. 3). Die isolierte Sinnesepithel können dann kultiviert wie in diesem Protokoll beschrieben werden. Diese Mikro-Isolierung Verfahren sollte für die enzymatische Trennung der Sinnesepithelien aus den umliegenden Gewebe 4 verglichen werden. In Säugetieren, wie auch Nicht-Säuger-Arten wie Hühner, Thermolysin Verdauung der isolierten Vestibularorgane Ergebnisse bei der Isolierung von Sinnesepithelien aus dem Keller mesenchymalen Zellen 4. In der Ratte Cochlea, Thermolysin Verdauung Ergebnisse bei der Trennung von der größeren Epithelkamm, weniger Epithelkamm und begleitende Sinnesepithelien von der Basalmembran 5. Es ist jedoch unklar, ob die Cochlea Sinnesepithel können die beschichteten Platten ohne die begleitende mesenchymalen Zellen anzuhängen. Während sowohl die mechanischen Mikro-Isolation-Methode und enzymatische Verdauung Ergebnis der Methode in der Trennung der Sinnesepithelien aus der Spirale Limbus Vorteile der Mikro-Isolat Dissektion über die Thermolysin Verdauung eine relativ kürzere Protokoll, billiger Reagenzien und potentiell weniger Stress dem Explantat durch enzymatische Wirkung der Verdauung. Darüber hinaus ist die Basalmembran intakt gelassen, in diesem Ansatz, der kann Befestigung der Sinnesepithel der Kulturplatte zu verbessern. Nachteile dieser Methode sind die Notwendigkeit, die Fähigkeiten für diese heikle Dissektion und mögliche mechanische Beschädigung der Sinnesepithel aus der Mikrodissektion zu entwickeln.
Als ein Beispiel für die Nützlichkeit dieses Verfahrens stellen wir auch ein Beispiel für die Verwendung der Orgel vonCorti Kulturen, die Elektroporation von exogenen Genen in dem Explantat Kultur. Die Elektroporation oben beschriebene Verfahren basiert auf den bisherigen Methoden der Corti-Organ Elektroporation basiert. Bemerkenswert ist, beschreiben Zheng und Gao (2000), die Elektroporation von isolierten Ratten-Organen Corti, wo die Explantate in Platz für die Elektroporation werden durch eine geformte Nut Agarose gehalten und dann auf Kollagen beschichtet 8-well LabTek Folie in serum-freiem Medium 2 beschichtet. Ein Vorteil ihres Ansatzes ist, dass die Organe so orientiert, dass die Oberseiten der Explantate der Kathode, die theoretisch in eine gleichmäßige Verteilung der Elektroporation Zellen in der Explantation sollte Ergebnis Gesicht. In unseren Händen jedoch die Methode, die wir beschreiben, auf dieses Verfahren verbessert, weil das Corti-Organ blieb angebracht, die Deckglas während des gesamten Verfahrens wodurch die Manipulation der Explantation nach der Elektroporation. Darüber hinaus blieb ein höherer Prozentsatz von Organen Corti die Deckgläser mit dieser vorgestellten Methode angebracht. Unsere Methode ist von Jones, et al. (2006) mit dem Zusatz der Fugene 6 Reagenz verwendet, um die Effizienz der Gen-Expression nach der Elektroporation erhöhen übernommen. In der Jones et al. (2006)-Protokoll, sind die Organe elektroporiert, inkubiert für 5 Minuten mit 100 ul Fugene 6 Transfektionsreagenz und vernickelt 6. Unsere Methode unterscheidet sich in der Verwendung eines 3:2-Verhältnis von Fugene 6 Reagenz Plasmid-DNA, die wir empirisch gefundene optimale transgene Expression mit einem Minimum an Toxizität liefern. Wir wollen nicht unverdünnt anwenden Fugene 6 Reagenz, das kann in der Toxizität der Kulturen führen. Die Elektroden-Konfiguration in unserem Protokoll, sowie Jones et al. (2006), Ergebnisse in primären Genexpression entweder in der Spirale Limbus oder Sinnesepithel abhängig von der Position der Kathode. Obwohl es DsRed-positive Zellen auf der Seite der Kultur fern der Kathode sind, gibt es eine höhere Konzentration von transgenen Zellen näher an der Kathode. Um eine vollständige Expression des Transgens in beiden Seiten des Corti-Organ Explantation, kann der Strom für eine zweite Impulsfolge durch einfaches Umdrehen der führt rückgängig gemacht werden. Das vorgestellte Protokoll Ergebnis sind robuste Expression des Transgens während der Corti-Organ (Abb. 5).
Die Autoren bedanken sich bei Demêmes Danielle und Douglas Cotanche danken und für ihre Bemühungen in der Lehre uns die Methoden zur Isolierung von Corti-Organ. Darüber hinaus möchten wir Ishmael danken Stefanov-Wagner für das Engineering der Elektroporator Elektroden; Sherry Lin für ihre beitragen Grafik, um die Video-Animation, und Matthew Chana, Jason Meeker, und Kendra Marshall ( www.goodfightproductions.com ) für die Produktion des Videos. Aus dem NIDCD Diese Arbeit wurde durch Stipendien (; RO1DC007174-Edge P30DC05209-MEEI Core Support für Hearing Research R03DC010065-Parker) finanziert.
Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
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Glass microscope coverslips | DYNALAB Corporation (Rochester, NY) | 2010 | 10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce | |
4 ringed cell culture dish | Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 627170 | Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO) | P4957 | 0.01% Solution | |
Laminin | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) | 354232 | made in mouse | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 26140-095 | Qualified | |
Operating scissors | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | RS-6806 | Straight, sharp-blunt length 5″ | |
#11 Scalpel Blade | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 372611 | ||
#4 Dumoxel forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11241-30 | ||
#55 Dumostar fine forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11295-51 | ||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 10564-011 | High Glucose | |
Horse Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 2605088 | Heat Inactivated | |
Ampicillin Sodium Salt | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11593-027 | Irradiated | |
½ cc Lo-Dose Insulin Syringe | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 329465 | U-100 28G½ | |
Fugene 6 Transfection Reagent | Roche (Mannheim, Germany) | 11-815-091-001 | ||
Polystyrene test tube | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 14-956-5A | ||
Laminar flow hood | The Baker Company (Stanford, ME) | Model SG603a | SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet |
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Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985 | ||
Reporter plasmid | Clontech (Mountain View, CA) | 632539 | pCMV DsRed-Express 2 | |
Electroporator | BioRad (Hercules, CA) | 165–2662 | BioRad Gene Pulser Xcell |