Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

Dag 1. Sterilisatie en coaten van glas dekglaasjes. Droog steriliseren glas microscoop dekglaasjes in een autoclaaf. Plaats de gesteriliseerde dekglaasjes in twee putten van een pre-gesteriliseerde vier-en celcultuur schotel. Coat de dekglaasjes met 1:1 poly-L-ornithine en laminine aangevuld met 20% foetaal runderserum (FBS) overnacht bij 4 ° C. 400 pi poly-L-ornithine (0,01% oplossing bewaard bij 4 ° C) 400 pi laminine (50 ug / ml stockoplossing opgeslagen in porties bij -20 ° C) 200 pi FBS (opgeslagen in porties bij -20 ° C) Warmte-steriliseren van de dissectie-instrumenten 's nachts in een 150 ° C incubator. Maak kweekmedium dat 10% serum en 10 mg / ml ampicilline. 90 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium 5 ml FBS (opgeslagen in porties bij -20 ° C) 5 ml paard serum (opgeslagen in porties bij -20 ° C) 10 pi ampicilline (10 mg / ml voorraadoplossing bewaard bij 4 ° C) Dag 2. Isolatie van het orgaan van Corti. Steriliseer de positieve stroom dissectie kap. zetten UV-licht gedurende 20 minuten spuiten alle oppervlakken met 70% ethanol en wacht 5 minuten voor gebruik. Onthoofden muis pup (P4) aan de basis van het foramen magnum met behulp van operationele schaar. Kort spoel het hoofd in 10 cm schotel met 70% ethanol. Verwijder de opperhuid met behulp van een scalpel. Open de schedel langs de pijlnaad met behulp van een scalpel en dan halveren de voorhersenen. Bewaar de caudale voorhersenen voor verdere dissectie. Verwijder de voorhersenen, de kleine hersenen en de hersenstam met stompe dissectie. Verwijder de tijdelijke botten (fig. 2A), dompel ze kort in 70% ethanol, en breng ze naar een 3 mm schotel met steriele HBSS. Met behulp van een tang, verwijder de bulla en het omliggende weefsel van de petrous gedeelte van het slaapbeen. Zoek de schelp vorm slakkenhuis (fig. 2B) en scheiden van het vestibulaire systeem met behulp van een tang. In deze fase van ontwikkeling, is het benige labyrint niet volledig verkalkt en is gemakkelijk te ontleed met behulp van een tang. Verwijder het benige labyrint van het slakkenhuis door een zorgvuldige scheiding te beginnen bij de basale einde en bewegende apicaal met behulp van een tang. De spiraal ligament en de bijgevoegde orgaan van Corti is opgerold langs de spiraal van de modiolus (fig. 2C). Verwijder voorzichtig het orgaan van Corti door het veiligstellen van de spiraal ligament aan de haak gebied van de basis met behulp van pincet en tot rust te komen als je beweegt apicaal. Beginnend bij de basis, verwijdert u de spiraal ligament van het orgaan van Corti met behulp van # 55 fijn pincet (fig. 2D). Micro-isolatie van het orgaan van Corti sensorische epitheel (optioneel). Verwijder het orgaan van Corti haak regio van de bodem met behulp van twee ½ cc insuline-injectiespuiten met permanent bevestigde U-100 28G ½ naalden als tang. Vanaf de top, verwijder de spiraal limbus van de rij binnenste haarcellen en ga verder basaal (fig. 2E-F). Plating het orgaan van Corti explantatie Haal de poly-L-ornithine/laminin/FBS oplossing uit de cultuur putten en voeg 130 ul van de cultuur medium. Breng de ontleed orgaan van Corti aan de gecoate glas dekglaasje in de cultuur goed en oriënteren van de explantatie, zodat de cilia van de haarcellen naar boven wijzen. Verwijder het medium in de cultuur goed met behulp van een 200 pi pipet. Zorg ervoor dat het basilair membraan stevig contact maakt met het gecoat glas dekglaasje aan. Voeg voorzichtig 130 pi kweekmedium aan het orgaan van Corti met behulp van een 200 ml pipet. Van toepassing zijn twee druppels op het oppervlak van het orgaan van Corti en dan langzaam de resterende volume toe te voegen aan de zijkant van de dekglaasje aan. Zorg ervoor dat het orgaan van Corti niet zweven in de cultuur media, maar blijft aangebracht op het dekglaasje. Incubeer overnacht bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO 2. Dag 3. Elektroporatie van de reporter-gen in gekweekte orgaan van Corti. Verwijder het kweekmedium van het orgaan van Corti cultuur. Voeg 130 uL H 2 O voor 1 minuut en daarna verwijderen met behulp van een 200 pi pipet. Voeg 30 ul van DsRed reporter plasmide (2 mg / ml H 2 O opgeslagen bij -20 ° C). Vooraf de elektroden van de electroporator met behulp van een micromanipulator, zodat de anode eennd kathode zijn aan beide kanten van de cultuur. Genereer een puls (27V, 30 ms duur, 10 pulsreeksen) om het reportergen electroporate in het orgaan van Corti explantatie cultuur. Optioneel: de polariteit van de pols houden om elektroporatie van het transgen zorgen op zowel de modiolar en de spiraal ligament zijden van de explantatie. Wacht 5 minuten. Voeg 130 ul van de Fugene 6: DNA-oplossing (3 delen Fugene tot 2 delen DNA). Deze oplossing moet voorafgaand aan de start van de elektroporatie procedure (stap 20) met behulp van een 3 ml ronde bodem polystyreen reageerbuis in een laminaire stroming kap worden voorbereid. Om deze oplossing te maken: Voeg 2,4 ul van Opti-MEM (opgeslagen bij 4 ° C) om de reageerbuis. Voeg 0,6 ul van Fugene 6 reagens (opgeslagen bij 4 ° C) om de reageerbuis. Zorg ervoor dat de Fugene direct toe te voegen aan de Opti-MEM en direct contact met de zijkanten van de reageerbuis te vermijden. Vortex gedurende 1 seconde. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 2,0 ul DsRed reporterplasmide dubbelstrengs DNA (opgeslagen bij -20 ° C bij 100 ug DNA / ml H 2 O monsters). Vortex gedurende 1 seconde. Incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 200 ul van kweekmedium. Vortex gedurende 1 seconde. Incubeer overnacht bij 37 ° C in 5% CO 2. Voeg 2 mL kweekmedium aan de cultuur goed en incubeer 37 ° C gedurende maximaal 10 dagen. Representatieve resultaten We presenteren een methode voor de isolatie van het orgaan van Corti van een perinatale muis. De procedure kan worden gebruikt voor muizen zo jong als embryonale dag 16 tot ongeveer postnatale dag 6, op welk punt de benige labyrint voldoende wordt verkalkte te maken van de dissectie omslachtig. Zodra het orgaan van Corti is ontleed, kan het worden uitgeplaat en gekweekt hetzij in haar geheel (fig 3) of als micro-geïsoleerde sensorische epitheel (fig 4). We hebben verder presenteerde een techniek om exogene genen tot expressie in de gekweekte orgaan van Corti. De organotypische cultuur is geschikt voor veel andere soorten onderzoek, zoals de analyse van het orgaan van Corti genexpressie met behulp van RT-PCR of in situ hybridisatie, het orgaan van Corti co-cultuur met spiraal ganglion cellen of exogene stamcellen met behulp van de micro-isoleren 3, of in vitro analyse van haar cel dood en regeneratie. Figuur 1. Doorsnede van de P4 muriene orgaan van Corti. (A) Een dwarsdoorsnede van de basale begin van een cryosectioned cochlea verkregen uit een P4 muis illustreert de algemene structuren van de muis cochlea beschreven in dit protocol. De scala media wordt begrensd door de spiraal ligament en stria vascularis lateraal, de Reissner s membraan superiorly, de spiraal limbus mediaal, en het basilair membraan inferiorly. De doos aangegeven de regio uitgebreid in B. (B) Het orgaan van Corti bevindt zich aan de superieure kant van het basilair membraan en bevat een rij binnenste haarcellen, drie rijen buitenste haarcellen, en hun respectieve ondersteunende cellen. Onderbroken lijn 1 geeft de locatie langs het basilair membraan dat is verwijderd tijdens dit orgaan van Corti dissectie. Onderbroken lijn 2 geeft de locatie langs het basilair membraan dat is verwijderd tijdens de micro-isolatie procedure. Groen geeft aan immunohistochemische kenmerken van calbindin, die interdentale cellen van de spiraal limbus, cochleaire haarcellen, spiraal ganglion neuronen, maar ook cellen van de spiraal ligament en stria vascularis 7 labels. DAPI de etikettering van kernen is in het blauw. Figuur 2. Orgaan van Corti dissectie. Beelden uit de bijbehorende video van het orgaan van Corti dissectie highlight A) van de cochlea en het evenwichtsorgaan zich in het geïsoleerde slaapbeen (rood), B), de benige labyrint van het slakkenhuis, C) de spiraal ligament en de bijgevoegde orgaan van Corti na het verwijderen van het benige labyrint, D) het verwijderen van de spiraal ligament en stria vascularis (rood) van het orgaan van Corti, E) micro-isolatie van de sensorische epitheel van de spiraal limbus (rood), en F) van de geïsoleerde spiraal limbus (links) en sensorische epitheel (rechts). Figuur 3. Gekweekte orgaan van Corti explant. DIC afbeelding met het orgel vanCorti van een P4 Atoh1-nGFP muis die geïsoleerd, verzilverd, en gekweekt werd vijf dagen zoals beschreven. Deze muis is genetisch zo gebouwd dat cellen die de pro-haarcel gen Atonal homoloog 1 (Atoh1 aka Math1) vertonen een groen fluorescerend eiwit dat is gelokaliseerd aan de kern 8. De organen van Corti van deze muizen vertonen een nucleaire GFP label in alle haar celkernen en daardoor zorgen voor eenvoudige visualisatie van de sensorische epitheel met behulp van een epifluorescerende microscoop. De relatief grote spiraal limbus kan worden gezien lateraal van de sensorische epitheel. Mesenchymale cellen die afkomstig zijn van het orgaan van Corti zijn weg gemigreerd van het explantatie. Blauwe nucleaire label is DAPI. Figuur 4. Micro-geïsoleerde sensorische epitheel. Epifluorescerende beeld verkregen van de zintuiglijke epitheel dat is geïsoleerd uit een P4 muriene orgaan van Corti, zoals beschreven en overnacht gekweekt. De micro-isolaat werd vervolgens in 4% paraformaldehyde en verwerkt voor immunokleuring van myosine 7a die cochleaire haarcellen labels. Let op de afwezigheid van de relatief grotere spiraal limbus uit de figuur 3. Blauwe nucleaire label is DAPI. Figuur 5. Elektroporatie van DsRed reportergen in de gekweekte orgaan van Corti. Hele organen van Corti van P4 Atoh1-nGFP muis pups werden geïsoleerd, beplaat, en vervolgens geëlektroporeerd met de DsRed reporter-gen, zoals beschreven en vervolgens bekeken onder een microscoop epifluorescerende. Cellen van het orgaan van Corti Explantatie dat de transgene DsRed reporter eiwit uitgedrukt vertonen een rode fluorescentie en endogene cellen van de sensorische epitheel vertonen een groene nucleaire fluorescentie. Transgene cellen kan worden gezien in de spiraal limbus en sensorische epitheel.