Di-8-ANEPPS ile İndüklenmiş Membran Gerilim Ölçme

Bölüm I: Ön adımlar Bu deneyde, Çin hamsteri over hücre hattı (CHO-K1) kullanılır. Hücreler,% 8 fetal buzağı serumu ile takviye HAM-F12 kültür ortamında ~ 0.7×10 5 hücre / ml, 0.15 mg / ml Lab-Tek II odaları (2 kuyu, 4 cm 2 Her) (Nalge Nunc, Almanya) kaplanmıştır L-glutamin, 16 mg / ml gentamisin (Sigma-Aldrich, Steinheim, Almanya), 200 adet / ml Crystacillin (Pliva'nın, Zagreb, Hırvatistan), ve 37% 5 CO 2 inkübe ° C Alternatif olarak, hücreler de böyle polylysine gibi hücresel bir yapıştırıcı ile kaplanmış # 1 cam kapak fişleri (kalın 0,13 ila 0,16 mm), kaplama olabilir. Hücrelerin kendi kültür ortamında inkübe edin. Kuluçka hala kabaca küresel, ancak kendi zarının küçük bir kısmı ile yüzeye sıkıca bağlı 2 ila 4 saat verimi hücreleri süren. Alternatif olarak, inkübasyon 16 ila 20 saat sonra, hücreler tamamen yüzeye bağlı ve daha karmaşık şekiller var, ama çoğu hala bölünmesi değildir. 843 ul DMSO (Sigma-Aldrich, Steinheim, Almanya), orjinal Invitrogen flakon boya, 5 mg ekleyerek di-8-ANEPPS (Invitrogen, Eugene, Oregon, ABD), 10 mM stok solüsyonu hazırlayın. Stok solüsyonu birkaç ay için 4 ° C'de buzdolabında saklanabilir. DMSO kristallerin çözünmesi kadar deneyler başlamadan önce, çözüm ısınmak. Bazı hücre dizilerinde hücre zarının içine boya dahil kolaylığı pluronic kullanımı gerekebilir. Pluronic% 20 DMSO (F-127, Invitrogen, Eugene, Oregon, ABD) stok solüsyonu veya DMSO pluronic eriterek tarafından hazırlanan aynı konsantrasyonda bir stok solüsyonu satın alınabilir. Pluronic stok solüsyonu oda sıcaklığında saklanabilir. Bölüm II: di-8-ANEPPS hücreleri yükleme 10 mM di-8-ANEPPS ve Minimum Temel Orta SMEM Spinner değişiklik 1 ml (kalsiyum-tükenmiş sürüm) (orta M8167 ve M4767, Sigma-Aldrich, Steinheim, Almanya% 20 pluronic 2.5 ul 3 ul Mix 1.5 ml Eppendorf tüp). Bu yaklaşık 30 mcM di-8-ANEPPS ve% 0.05 'pluronic içeren bir "yükleme çözüm" ortaya çıkarır. Diğer hücre türleri için, doğdukları kültür ortamı yerine SMEM kullanılabilir. Lab-Tek odasında yükleme çözümü ile kültür ortamı değiştirin. 10 dakika boyunca buzdolabında 4 odanın transfer ° C Bu sıcaklık, plazma zarı ile boya içselleştirilmesi büyük ölçüde inhibe edilir. Boyama sonra, yavaşça saf SMEM fazla boya ile 2-3 kez yıkayın. SMEM odasında 1,5 ml bırakın. Bölüm III: Deney ve görüntü alımı Hücreleri immersiyon yağı hedefi (X63, NA 1.4), monokromatör (Polychrome IV, Visitron, Almanya) ve soğutmalı bir CCD kamera (VisiCam ile donatılmış bir floresan mikroskobu (bizim durumumuzda Zeiss AxioVert 200, Zeiss, Almanya) kullanılarak gözlenmektedir 1280, Visitron, Almanya). MetaFluor 7.1.1 ile elde edilen görüntüleri ve (her ikisi de Moleküler Cihazlar, Downingtown, PA, USA) MetaMorph 7.1.1 işlenmiş, ancak diğer benzer satın alma yazılımı da kullanılabilir. Dalgaboyu 490 nm kazanım yazılım ayarlayın ve örneğin ANEPPS uygun bir emisyon filtresi, 605 nm 'de merkezlenmiş bir bant geçiren filtre (605/55m, dikroik 565 DCXR, Chroma, Rockingham, VT, ABD) seçin. Monokromatör mevcut değilse, 490 nm 'de merkezlenmiş bir harekete geçirici filtre yerine kullanılabilir. Odasının altındaki hücreleri mikroskop sahneye odasına yerleştirin, Elektrotların pozisyonu ve darbe jeneratörü bağlayın. Orta elektrotlar kapsamalıdır. Hücre canlılığını korumak ve ısıtma azaltmak için, darbe yeterince düşük genlikli ve kısa süreli olmalıdır. Bu deneyde 35 V genlik ve 50 ms süresi (elektroporasyon önlemek için yeterince düşük) sahip bir kare dalga, bir DC gerilim kaynağı ve ısmarlama bir mikroişlemci kontrollü switcher cihaz kullanılarak oluşturulur. Alternatif olarak, 33210A (Agilent, Santa Clara, CA, USA) gibi ticari bir darbe jeneratörü, bir amplifikatör veya S88 (Çimen, West Warwick, RI, ABD) gibi ticari bir uyarıcıdır bağlı kullanılabilir. Darbe, bir elektrik alan elektrotlar ve indükleyici ΔΦ arasında yaklaşık 88 V / cm, 0.8 mm çapında ve 4 mm aralarındaki mesafe iki paralel Pt / Ir tel elektrotlar teslim edilir. Bu deneyde kullanılan elektrot arasındaki alan dağılımı tam olarak başka bir yerde [1] olarak tarif edilir. Ilgi hücreleri bulun. Tek bir elektrik darbe veya darbe dizisi uygulayın. : Her darbe için, iki floresan görüntüler elde darbe (kontrol görüntü) hemen önce ve puls (darbe görüntü) sırasında biri. Di-8-ANEPPS düşük tepki nedeniyle, floresan değişiklikler çıplak gözle ayırt ve belirgin onl olmak zordur.işlendikten sonra y. Nabız teslimat kazanım yazılım bir özelliği olan görüntü satın alma, senkronize olmalıdır. Isıtma photobleaching ve olası önlemek için, aydınlatma, darbe süresi ile sınırlı olabilir. Bölüm IV: Görüntü işleme ve analiz MetaMorph yazılım görüntüleri açın. Her darbe için, kontrol ve nabız görüntü hem de arka plan çıkarmak. Bir hücre seçin ve membran karşılık gelir, böylece faiz bölgeyi ayarlayın. Floresans şiddetleri kontrol ve nabız resmi bu bölgede boyunca ölçün ve bir elektronik tablo değerleri aktarmak. Her darbe için nabız verileri kontrol veri toplama, çıkarma, ve göreli floresan değişiklikleri elde etmek için kontrol verileri sonucu bölmek. Darbe bir dizi uygulanırsa, her darbe için belirlenen göreceli floresan değişikliklerin daha güvenilir bir ölçüm değerleri elde etmek için ortalama olabilir. ΔΦ içine bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak göreceli floresan değişiklikler dönüştürün. Bu eğrinin literatürden elde edilen kaba bir tahmin, ama daha yüksek doğruluk için, her kurulum için ölçülebilir. Bu deneyde kullanılan hücreleri ve kurulum için floresan% 6'lık bir azalma ΔΦ [2] 100 mV artışı karşılık gelir. Son olarak, göreli yay uzunluğu Excel (Microsoft Corp, Redmond, WA, ABD), Sigma Arsa (Systat Software Inc, San Jose, CA, USA) gibi bir grafik yazılım paketi bir fonksiyonu olarak gerilim arsa, veya Kökeni (OriginLab Corp, Northampton, MA, ABD). Eğrisi de bu hareketli ortalama filtre olarak uygun bir filtre kullanılarak düzeltilmelidir.