文化和维护人类胚胎干细胞

1。维护：在显微镜下观察文化从37℃培养箱中取出胚胎干细胞的板和带来的显微镜。 注意在低功率的殖民地，使用2倍或5倍的放大倍率，以评估整体文化素质。请注意以下几点：中等颜色正常，没有任何可见的污染，整个聚落的大小，质量和密度，以及任何其他意见。 观察中的颜色变化。由于在pH值的变化和孵育过夜后，与胚胎干细胞的培养基中的营养物质耗尽，介质会改变一个红色的“救命稻草”的色彩。如果中期出现紫色的，一个基本的pH值变化已经发生。如果介质出现极其黄色，中型酸化。很黄介质可能会非常拥挤的殖民地井或污染的结果。媒介应该出现在任何时候都清楚的。虽然在中期的细胞碎片一定程度是正常的，它不应该出现浑浊。如果观察到一个高水平的细胞碎片，文化健康及可能被污染。 如果文化不要求维修或传代，他们可以采取的生物安全柜，美联储（见第2节）。 如果文化中含有约10％，区分菌落多，细胞应该是“清理”手动删除有区别的地区（见第3节）。 如果文化包含大或密集的殖民地，或MEF饲养层超过12天，应传代细胞（见第4节）。 2。进料胚胎干细胞在无菌的生物安全柜，取出培养皿的盖子，并吸出花了中等。不要让吸管尖碰板直接内水井以外的任何部分。如果有任何的污染问题，改变到一个新的，无菌的吸管。 使用无菌玻璃吸管，回暖的胚胎干细胞培养液中添加适量的每口井。对于在6孔板文化，每孔加入2.5毫升培养基。 返回板的孵化器，以保持在37 ° C和5％的CO 2 。 3。删除从胚胎干细胞培养分化采摘工具转换成9英寸的玻璃巴斯德吸管成型控制在酒精灯火焰的提示。可以肯定的吸管尖密封，以防止污染和圆角，避免划伤塑料培养皿。消毒前使用生物安全柜在使用紫外线光源，或采摘外壳采摘工具。 删除有区别的地区。分化往往发生在一个胚胎干细胞集落，通常沿着边缘或中心隔离点，只有一部分。如果只有一个殖民地的部分是区分的，只有差异化方面的需求被删除。分化往往可以解除“粘”表板，它是有帮助的首次单独从殖民地的其余部分分化的细胞，由殖民地通过绘制一条线，采摘工具。 一旦殖民地的部分分离出来，轻轻地沿板滑行采摘工具，以分离不需要的细胞。小心不刮走太多的MEF饲养层之间在这一进程中的殖民地。 当分化的细胞都是从板（和浮在中期）删除，回归文化的生物安全柜。吸分化细胞的培养基中含有与新鲜胚胎干细胞培养液更换。 4。传代胚胎干细胞酶孵化在无菌的生物安全柜，取出的6孔培养皿的盖子，并从代井吸花的介质。不要让吸管尖碰板直接内水井以外的任何部分。 使用无菌玻璃吸管，添加1毫升回暖胶原酶以及每个要传。 5分钟，37℃孵化器返回板块。 刮池的胚胎干细胞在培育的细胞胶原酶，在显微镜下观察的殖民地。这种酶，应引起一个微妙而明显的变化，在殖民地边缘。 在生物安全柜，轻轻吸出每口井的酶和取代2.0毫升胚胎干细胞培养液中。 提示稍对你的培养板，并用5毫升的玻璃吸管取2.0毫升培养基中的第一口井。拿着吸管垂直板底部，轻轻地滑过整个以及吸管尖，一边慢慢释放介质。 重复的拼抢和pipetti议员的议案3-4次，直到所有的殖民地已被调离井。吸取轻轻避免太小件分解成殖民地。当细胞从第一口井已被删除，留下的内容，并在井开始刮的未来以及细胞。 当所有要传的井已被刮掉，池的培养基中含有从每口井在无菌的15 mL锥形管的殖民地件。 胚胎干细胞培养液中加入1毫升每口井的冲洗刮井。收藏本冲洗，并转移到锥形管。 吸取的细胞轻轻地在管分手殖民地件所需的大小。 5分钟后，细胞离心200 × G. 电镀胚胎干细胞的细胞虽然胚胎干细胞在离心机，准备一个新的6 MEF馈线板。标签：细胞系与适当的胚胎干细胞的信息板，新的通道数量，并通过日期。从水井吸的MEF介质，每孔加入1.0毫升的PBS。轻轻旋流井周围的缓冲区和吸出PBS冲洗。加入1.5 mL的胚胎干细胞培养液中，每孔和预留设置的板块。 当胚胎干细胞完成离心，使管的生物安全柜。吸出上清液，小心不要去打扰松散包装的细胞沉淀。 颗粒细胞重悬于1毫升胚胎干细胞培养液中，每孔镀足够的介质。当分裂成6口新井，6毫升培养基中的颗粒悬浮。 1毫升细胞悬液，轻轻地，均匀地添加到每个准备MEF馈线板。 放置到37℃孵化器板，小心地将板着回来，方方，均匀地分布在整个以及细胞。 允许细胞附加在37 ° C过夜。 5。代表性的成果： 未分化的胚胎干细胞是小的，紧密包装，通常包括更大，更出细胞扩散。在殖民地（图1A）或殖民地（图3B）之间的分化可能会发生。 在低倍率显微镜下下可以看到不同的morhopologies。在图2a可见，一个良好的细胞形态，包含小，单层生长的细胞排列紧密。细胞应该具有清洁，定义的边缘，几乎没有差异。在图2b所示的细胞传代，都是人满为患，在图2C所示的细胞。 图1。分化的胚胎干文化 （一）（二）分化殖民地之间的殖民地的分化。 图2。在hES文化形貌看到 。 （一）（二）良好的细胞形态的胚胎干细胞，传代（三）拥挤的牢房准备。