Préparation des suspensions unicellulaires à partir de rate de souris avec le dissociateur gentleMACS

Introduction à l'équipement Le tissu est légèrement dissocié, en utilisant le violet Tubes C dans viables unicellulaires suspensions. Le tampon PBS / BSA EDTA est utilisé pour dissocier les cellules. Le tampon est préparé en ajoutant une partie de la solution stock de BSA à 20 parties de solution de rinçage autoMACS contenant de l'EDTA. Le MACS Pré-Séparation filtres sont utilisés pour que les échantillons de tissus dissociés sont libres de tous les amas cellulaires, la promotion réussie de séparation MACS et l'analyse subséquente. Dissocier les cellules de la rate Rate entiers sont disscociated dans une seule cellule de suspensions de splénocytes utilisant le dissociateur gentleMACS. Pour commencer la procédure, la charge du tube C avec un volume de tampon en fonction de la masse de la rate. Une rate saine d'un adulte jeune femelle souris BALB / c pèse environ 80-120 mg. Aux 1 à 2 rates de cette masse besoin de 3 mL de tampon. Rates provenant d'animaux âgés ou des animaux atteints d'infections sont souvent plus grandes et doit être pesé dans la mémoire tampon. Les volumes de tampon doit être modulée en conséquence. Ne pas dépasser un volume tampon total de 10 ml. Ajouter la rate disséqués pour le tube C contenant 3 ml de tampon. Assurez-vous que le bouchon du tube C est serré et fixer le tube C de la dissociateur avec le bouchon vers le bas. Mettez le dissociateur. Pour 1-2 rate, sélectionnez m_spleen_01 programme. Le programme va prendre 56 secondes pour terminer. Si le nombre des rates est supérieure, l'utilisation du programme m_spleen_04, ce programme peut être utilisé pour un maximum de 720 mg de tissu splénique. Après l'achèvement du programme du tissu splénique natif est dissocié en une suspension de splénocytes. Isoler la suspension de cellules entières au 300xg à température ambiante pendant environ 30 secondes. Cela garantira que le rotor et le stator sont libérés de toutes les cellules qui sont recueillis au fond du tube C. Retirer l'échantillon à travers le septum étanche ouverture dans le capuchon du tube C en utilisant un pipetteur 1000 microlitre. Étape de filtration Pour commencer l'étape de filtration, appliquer le tissu dissocié de la pré-filtre de séparation ou une passoire cellule avec 30 um de taille des pores. Le tamis doit s'adapter à un tube de 15 ml pendant 1-2 rate ou un tube de 50 ml pendant plus de 2 rates. Laissez la suspension cellulaire passer à travers. Puis laver le filtre en appliquant 5 ml de tampon. Maintenant, centrifuger le tube avec la suspension cellulaire à 300xg, à température ambiante pendant 10 minutes pour recueillir toutes les splénocytes dans une cellule de la rate à granulés. Maintenant, que nous avons une pastille de splénocytes dissociés, nous devons aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans une quantité appropriée de mémoire tampon. La dissociation rate utilisant le dissociateur gentleMACS donnera un pourcentage élevé de splénocytes viable, ce qui est démontré par cytométrie en flux à l'aide de l'analyseur MACSQuant. Les cellules mortes sont colorées par de l'iodure de propidium. Dans l'exemple fourni, l'intrigue avant du côté de dispersion point indique les splénocytes préparé.