오직 전령RNA(messenger RNA, 줄여서 mRNA)에 전사된 유전자만이 활성화되거나 발현됩니다. 따라서 과학자들은 여러 세포와 조직의 유전자 발현을 연구하기 위해 세포에서 mRNA를 추출할 수 있습니다. 이는 역전사(reverse transcription)를 통해 mRNA를 상보적 DNA(complementary DNA, 줄여서 cDNA; 상보 DNA)로 변환해 이뤄집니다. mRNA는 인트론(intron; 비암호화 영역) 및 기타 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하지 않기 때문에, cDNA는 유전자가 암호화하는 펩타이드(peptide)의 아미노산 서열을 과학자들이 직접 확인할 수 있게 합니다.
cDNA는 여러 가지 방법으로 생성할 수 있지만, 일반적인 방법은 먼저 세포에서 총 RNA를 추출한 다음 mRNA를 세포에 mRNA보다 많이 있는 운반RNA(transfer RNA, 줄여서 tRNA)와 리보솜 RNA(ribosomal RNA, 줄여서 rRNA)에서 분리하는 것입니다. 진핵생물(eukaryote)의 성숙 mRNA(mature mRNA)는 3’ 말단에 아데닌(adenine) 뉴클레오타이드(nucleotide)의 사슬인 폴리 A 꼬리(poly A tail)를 가지고 있지만, 다른 유형의 RNA는 그렇지 않습니다. 따라서, 타이민(thymine; 티민) 뉴클레오타이드의 사슬(oligo-dTs)을 컬럼(column)이나 자기 비드(magnetic bead)와 같은 기질(substrate)에 결합시켜 이를 이용해 mRNA의 폴리 A 꼬리와 특이적으로 염기쌍을 이루게 만들 수 있습니다. 폴리 A 꼬리를 가진 mRNA가 포착되는 동안, 다른 유형의 RNA는 씻겨 내려갑니다.
그다음, 역전사효소(reverse transcriptase; 레트로바이러스의 DNA 중합효소)를 mRNA로부터 cDNA를 생성하는 데 사용합니다. 역전사효소는 대부분의 DNA 중합효소(DNA polymerase; DNA 폴리머레이스)와 마찬가지로 사슬의 3’ 말단에만 뉴클레오타이드를 첨가할 수 있기 때문에 폴리 T 프라이머(primer; 시발체)를 추가해 cDNA 합성의 시발점을 제공합니다. cDNA 가닥은 헤어핀 구조(hairpin loop)로 끝납니다. 그런 다음 (일반적으로 알칼리 처리 또는 RNase(ribonuclease; 리보핵산가수분해효소) 효소를 사용해) RNA를 분해합니다. 단일 가닥 cDNA는 그대로 유지됩니다.
그런 다음 cDNA에 상보 되는 두 번째 DNA 가닥을 DNA 중합효소로 합성하는데, 여기서 종종 첫 번째 cDNA 가닥의 헤어핀 구조 또는 mRNA의 잘린 조각(nicked piece)을 프라이머로 사용합니다.
이렇게 얻은 이중 가닥 cDNA는 박테리아나 바이러스 벡터에 삽입되고 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 복제될 수 있습니다. 관심 세포나 조직의 모든 mRNA를 나타내는 cDNA 라이브러리도 추가 연구를 위해 구성할 수 있습니다.
