Seuls les gènes transcrits en ARN messager (ARNm) sont actifs ou exprimés. Les scientifiques peuvent donc extraire l’ARNm des cellules pour étudier l’expression des gènes dans différentes cellules et tissus. Le scientifique convertit l’ARNm en ADN complémentaire (ADNc) par transcription inverse. Étant donné que l’ARNm ne contient pas d’introns (régions non codantes) et autres séquences régulatrices, l’ADNc, contrairement à l’ADN génomique, permet également aux chercheurs de déterminer directement la séquence d’acides aminés du peptide codé par le gène.
L’ADNc peut être généré par plusieurs méthodes, mais une manière commune est d’extraire d’abord l’ARN total des cellules, puis d’isoler l’ARNm des types plus prédominants — l’ARN de transfert (ARNt) et l’ARN ribosomal (ARNr). L’ARNm eucaryote mature a une queue poly(A) — une chaîne de nucléotides d’adénine — ajoutée à son extrémité 3’, alors que d’autres types d’ARN n’en ont pas. Par conséquent, une chaîne de nucléotides de thymine (oligo-dTs) peut être fixée à un substrat tel qu’une colonne ou des billes magnétiques, pour former un appariement de bases spécifique avec les queues poly(A) de l’ARNm. Alors que l’ARNm avec une queue poly(A) est piégé, les autres types d’ARN sont emportés lors du lavage.
Ensuite, la transcriptase inverse — une enzyme d’ADN polymérase des rétrovirus — est utilisée pour générer l’ADNc à partir de l’ARNm. Puisque comme la plupart des ADN polymérases, la transcriptase inverse ne peut ajouter des nucléotides qu’à l’extrémité 3’ d’une chaîne, une amorce poly(T) est ajoutée pour se lier à la queue poly(A) afin de fournir un point de départ pour la synthèse de l’ADNc. Le brin d’ADNc se termine en boucle d’épingle à cheveux. L’ARN est alors dégradé — généralement avec un traitement alcalin ou des enzymes RNase — laissant l’ADNc à simple brin intact.
Un deuxième brin d’ADN complémentaire à l’ADNc est ensuite synthétisé par l’ADN polymérase, souvent à l’aide de la boucle d’épingle à cheveux du premier brin d’ADNc ou d’un morceau entaillé de l’ARNm comme amorce.
L’ADNc à double brin qui en résulte peut être inséré dans des vecteurs bactériens ou viraux et cloné à l’aide de techniques de biologie moléculaire standard. Une bibliothèque d’ADNc, représentant tous les ARNm dans les cellules ou les tissus d’intérêt, peut également être construite pour des recherches supplémentaires.
