在真核细胞中，DNA复制是高度保守和严格调控的。在细胞分裂之前，多条线性染色体必须以高保真度复制，因此有许多蛋白质在复制过程中扮演特殊的角色。复制发生在三个阶段：起始、伸长和终止，在细胞核中以两套完整的染色体结束。
真核生物复制遵循许多与原核DNA复制相同的原理，但由于基因组大得多，染色体是线性的而不是圆形的，这一过程需要更多的蛋白质，并且有一些关键的区别。复制在沿着每个染色体的复制的多个起源同时发生。起始蛋白识别并结合起源，吸收螺旋酶来解开DNA双螺旋。在每个原点，形成两个复制分叉。引物酶然后将短RNA引物添加到DNA的单链上，作为DNA聚合酶结合并开始复制序列的起点。DNA只能在5到3个方向上合成，因此从一个复制叉复制两条链的过程有两个不同的方向。主导链是连续合成的，而滞后链是在短距离合成100-200碱基对，称为冈崎片段。一旦大部分的复制完成，核糖核酸酶移除核糖核酸酶引物，DNA连接酶连接新链中的任何间隙。
在真核生物中复制DNA的工作量分为多种不同类型的DNA聚合酶。所有生物体内的DNA聚合酶的主要家族都是根据其蛋白质结构和氨基酸序列的相似性来分类的。最先被发现的家族被称为A、B、C和X，Y和D家族随后被确认。真核生物中的B族聚合酶包括Pol α它在复制叉处也起着一种初级酶的作用，Pol δ 和 ε 这两种酶分别在模板的前链和后链上完成DNA复制的大部分工作。其它DNA聚合酶负责修复DNA损伤、复制线粒体和质体DNA，以及在RNA引物被移除后填补滞后链DNA序列中的空白。
因为真核生物的染色体是线性的，它们很容易在末端被降解。为了保护重要的遗传信息免受损伤，染色体末端含有许多高度保守的富含G的DNA的非编码重复：端粒。染色体两端的短单链3与特定蛋白质相互作用，使染色体稳定在细胞核内。由于滞后链的合成方式，一小部分端粒DNA不能随细胞分裂而复制。结果，端粒在许多细胞周期中逐渐变短，可以作为细胞老化的标志。某些细胞群，如生殖细胞和干细胞，表达端粒酶，一种延长端粒的酶，使细胞在端粒缩短之前经历更多的细胞周期。
