ゲルシフトアッセイ (EMSA)
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Panoramica
ゲルシフトアッセイ (EMSA) は、タンパク質や核酸の間のバインディングを明らかにするために使用生化学的なプロシージャです。このアッセイ標識核酸およびテスト蛋白質が混在します。バインディングは、質量に基づくコンポーネントを分離するゲルの電気泳動によって決められてタメて構造。
このビデオは、EMSA とゲルおよび蛋白質の準備、バインド、電気泳動、検出などの一般的な手順の概念を示しています。このビデオで説明したアプリケーションには、クロマチンの酵素、biontinylation が組み込まれた変更された EMSA の分析と結合性細菌の応答調節物質に関する研究が含まれます。
EMSA、電気泳動の移動性シフト試金のゲル シフト試金とも呼ばれますは、汎用性と敏感な生化学的なプロシージャです。EMSA はゲルの電気泳動のバンドの変化に着目したタンパク質と核酸との間のバインディングを解明します。
このビデオは、EMSA の原則を説明、一般的な手順について説明します、いくつかのアプリケーションについて説明します。
DNA 複製、転写と修理、として RNA プロセシングは、すべての重要な生化学的なプロセスです。皆はタンパク質と核酸との結合を含みます。多くの深刻な病気や疾患は、このバインディングの変更に関連付けられます。EMSA は、質的特定の蛋白質が特定の核酸にバインドするかどうかを決定するための手法です。まず、核酸が付いて、通常放射性リン-32、プローブを作成します。その後、テスト蛋白質および核酸プローブを混合します。核酸プローブに結合するタンパク質、結果として得られる複合体は核酸だけよりも異なる構造と質量が大きい。
バインドされた後、複合体はゲル電気泳動で分析されます。この手法では、電界は、高分子ゲルのマトリックスを通して移行するを強制します。コンポーネントは、に基づいて質量・電荷・ コンフォメーションを区切ります。電気泳動は、バインドされていないプローブからタンパク質・ DNA 錯体を区切ることができます。彼らは異なる質量と立体配座を持っている、ので、彼らは異なるレートでゲルを通る移行し、分離します。分離は、放射性リンの存在のおかげで簡単に検出し、蛋白質は特定の核酸に正常にバインドを証明します。蛋白質の識別を確認するには、「supershift 分析」は知られている蛋白質に親和性抗体を使用します。さらに解像度は高く、複合体をシフトの付加的な利点があります。
今、我々 は原則を見てきました、ラボでしてみましょう。
手順を開始するには、タンパク質が分離である必要があります。これを行うには、分子生物学的手法、細胞の蛋白質を表現し、浄化されます。
核酸増幅は、プローブを作成するラベルします。ラベリングは、放射性リン 32 を含む dCTP を 10 分間インキュベーションを介して行われます。放射線の安全なワークベンチと保護具が必要です。
ゲルは、用意しています。ゲル非変化、蛋白質の構造を変更して可能性のある電気泳動中にプローブからバインド解除を防ぐする必要があります。ポリアクリルアミドゲルの長さに 5 を 20 nm と短いプローブ 100 塩基対までの役に立つの細孔径があります。Agarose のゲルは 70-700 nm の細孔径を持ち、大きいプローブ用に便利です。
タンパク質と核酸プローブの準備、我々 はバインドに進みます。トリス緩衝液を用意し、タンパク質とプローブが追加されます。PH を生理的条件と塩濃度のタンパク質が非標的核酸と弱い結合を形成することを防ぐために十分にする必要があります。4 ° C で 20-30 分のため反応が進む
次のステップは電気泳動です。低イオン強度および結合の反作用で使用されるような pH のバッファーが利用されています。錯体を安定化、モビリティを向上させ、熱発生は少なく、「ケージ効果」が得られます。電気泳動後のゲルのコンポーネントは、フィルター紙の上に転送されます。暗い部屋では、フィルター ペーパー、フィルムに公開されます。プローブに結合するタンパク質と、2 つの異なるラベルの付いた領域は転送で表示されます。コンプレックスを表す 1 つと非連結のプローブを表す別の 1 つ。分離は、核酸に蛋白質が正常にバインドされることを示します。
今では基本的な手順を見てきた、いくつかのアプリケーションを見てみましょう。
クロマチンは、DNA および真核細胞に存在する蛋白質の堅く詰められた複合体であります。酵素のクロマチン転写する DNA を開く構造に変更します。複合体の移動を変更、EMSA を使用して酵素の結合活性を探索できます。
分類に別の方法でメチル基転移酵素酵素と DNA との相互作用を活用しています。補足因子は、DNA メチル基転移酵素を介して完全にバインドする変更できます。リン 32 のラベルではなく補因子、ビオチンには放射性ではないために、有利な活用します。補因子は特定の添付ファイルで、遺伝子型、メチル化検出及び遺伝子デリバリーに関連します。Biotinilated 核酸は紫外線蛍光を介して検出されます。
環境の刺激は、ヒスチジンのキナーゼをアクティブにしたとき、「応答レギュレータ」でリン酸化されます。DNA の転写、EMSA によって学ぶことができますに影響を与えるにバインドされ、順番。例えば、興味の遺伝子にバインドするデスルフォビブリオ属尋常性の応答調節因子を示した。EMSA のバインディングが行われたことを確認する使用されました。
ゼウスの電気泳動の移動性シフト試金のビデオを見てきただけ。今操作、その手順とその主要な動作パラメーターの手順の原則を理解する必要があります。
見てくれてありがとう!
Procedura
Divulgazioni
Trascrizione
EMSA, the electrophoretic mobility shift assay, also known as the gel shift assay, is a versatile and sensitive biochemical procedure. EMSA elucidates binding between proteins and nucleic acids by detecting a shift in bands in gel electrophoresis.
This video describes the principles of EMSA, provides a general procedure, and discusses some applications.
DNA replication, transcription, and repair, as well as RNA processing are all critical biochemical processes. They all involve binding between proteins and nucleic acids. Many serious diseases and disorders are associated with modifications in this binding. EMSA is a technique for qualitatively determining whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled, usually with radioactive phosphorus-32, to create a probe. Then the test protein and nucleic acid probe are mixed. When a protein binds to a nucleic acid probe, the resulting complex has greater mass and a different conformation than the nucleic acid alone.
Once bound, the complexes are analyzed with gel electrophoresis. In this technique, an electric field forces macromolecules to migrate through a gel matrix. The components separate based on mass, charge, and conformation. Electrophoresis can separate protein-DNA complexes from unbound probes. Since they have different masses and conformations, they will migrate through the gel at different rates and separate. The separation is easily detected, thanks to the presence of the radioactive phosphorus, and proves the protein successfully binds to the given nucleic acid. To verify the identification of the protein, a “supershift assay” uses an antibody with a known affinity to the protein. This has the added benefit of further shifting the complex, increasing resolution.
Now that we’ve seen the principles, let’s see it in the lab.
To begin the procedure, the protein must be isolated. To do this, molecular biology techniques are used to express the protein in cells, and then purify.
The nucleic acid is amplified and labeled to create a probe. Labeling is done through incubation for 10 min with dCTP containing radioactive phosphorus-32. A radiation-safe workbench and protective equipment are required.
The gel is then prepared. The gel needs to be non-denaturing, to prevent the protein from altering conformation and potentially unbinding from the probe during electrophoresis. Polyacrylamide gels have pore sizes of 5 to 20 nm and are useful for short probes up to 100 base pairs in length. Agarose gels have pore sizes of 70-700 nm and are useful for larger probes.
With the protein and nucleic acid probe now prepared, we proceed to binding. A TRIS buffer solution is prepared and the protein and probe are added. The pH should be similar to physiological conditions, and salt concentration sufficient to prevent the protein from forming weak bonds with non-target nucleic acids. The reaction proceeds for 20-30 min at 4 °C.
The next step is electrophoresis. A buffer of low ionic strength and a pH similar to that used in the binding reaction is utilized. It yields a “caging effect” that stabilizes complexes, increases mobility, and reduces heat generation. After electrophoresis, the components of the gel are transferred onto filter paper. In a dark room, the filter paper is then exposed to film. If the protein binds to the probe, two distinct labeled regions will be visible in the transfer. One representing the complex, and a separate one representing the unbound probe. The separation demonstrates that the protein successfully bound to the nucleic acid.
Now that we’ve seen the basic procedure, let’s look at some applications.
Chromatin is the tightly packed complex of DNA and proteins found eukaryotic cells. Chromatin-remodeling enzymes modify the structure to open the DNA to transcription. As this changes the mobility of the complex, EMSA can be used to explore the binding activity of the enzyme.
An alternate approach to labeling takes advantage of the interaction between DNA and the methyltransferase enzyme. A cofactor can be modified to bind permanently to DNA via methyltransferase. Rather than labeling with phosphorus-32, the cofactor is conjugated to biotin, which is advantageous because it’s not radioactive. Because the cofactor is site-specific in its attachment, it’s relevant to genotyping, methylation detection, and gene delivery. The biotinilated nucleic acids are detected through ultraviolet fluorescence.
When environmental stimuli activate histidine kinases, a “response regulator” is phosphorylated. This in turn binds to DNA, affecting transcription, which can be studied by EMSA. For instance, a response regulator in Desulfovibrio vulgaris was demonstrated to bind to the gene of interest. EMSA was used to verify that the binding took place.
You’ve just watched JoVE’s video on the electrophoretic mobility shift assay. You should now understand its principles of operation, the steps in its procedure, and its major operating parameters.
Thanks for watching!
