Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi
Summary
Bu protokol, embriyonik 15-16. günlerde fare embriyolarından izole edilen primer nöronal hücrelerden ve doğum sonrası 1-2. günlerde yenidoğan farelerinin beyinlerinden üretilen primer mikrogliadan kurulan bir mikroglia-nöronal ko-kültürü tanımlar.
Abstract
Mikroglia, merkezi sinir sisteminin (CNS) dokuda yerleşik makrofajlarıdır ve nöronal sağlığı ve CNS homeostazını destekleyen çok sayıda işlevi yerine getirir. Multipl skleroz (MS) gibi kronik nörodejeneratif hastalıklar sırasında nöronal hasara potansiyel olarak katkıda bulunan reaktif fenotipleri benimseyen, CNS hastalığı aktivitesi ile ilişkili önemli bir bağışıklık hücresi popülasyonudur. Mikroglia’nın sağlık ve hastalık sırasında nöronal fonksiyonu ve sağkalımı düzenlediği farklı mekanizmalar, mikroglia, nöronlar ve diğer CNS çevresel faktörleri arasındaki karmaşık in vivo etkileşimlerin çözülmesindeki zorluklar nedeniyle sınırlı kalmaktadır. Bu nedenle, mikroglia ve nöronların birlikte kültürlenmesine yönelik in vitro yaklaşım, mikroglia-nöronal etkileşimleri incelemek için değerli bir araç olmaya devam etmektedir. Burada, farelerden birincil mikroglia ve nöronlar üretmek ve birlikte kültürlemek için bir protokol sunuyoruz. Spesifik olarak, mikroglia, doğum sonrası 0-2 günleri arasında yenidoğan farelerden türetilen beyin homojenatlarından oluşturulan karışık bir glia kültüründen in vitro 9-10 gün sonra izole edildi. Nöronal hücreler, embriyonik 16-18. günler arasında fare embriyolarının beyin kortekslerinden izole edildi. 4-5 gün sonra in vitro olarak, nöronal hücreler 96 oyuklu plakalara ekildi, ardından ko-kültürü oluşturmak için mikroglia ilavesi yapıldı. Bu protokol için dikkatli zamanlama çok önemlidir, çünkü her iki hücre tipinin de ko-kültürü oluşturmak için deneysel olgunluğa ulaşması gerekir. Genel olarak, bu ko-kültür, mikroglia-nöron etkileşimlerini incelemek için yararlı olabilir ve immünofloresan mikroskobu, canlı görüntüleme, RNA ve protein tahlilleri dahil olmak üzere çoklu okumalar sağlayabilir.
Introduction
Mikroglia, merkezi sinir sisteminde (CNS) immünosürveyans ve homeostazı kolaylaştıran dokuda yerleşik makrofajlardır1,2,3. Embriyonik gelişim 4,5,6 sırasında beyni kolonize eden yolk kesesi eritromiyeloid progenitör hücrelerden kaynaklanırlar ve proliferasyon ve apoptozuiçeren kendi kendini yenileme yoluyla organizmanın yaşam süresi boyunca korunurlar 7. Kararlı durumda, dinlenme mikrogliaları dallanmış morfolojiye sahiptir ve doku sürveyansına girer 8,9,10.
Mikroglia, CNS’deki değişikliklere hızlı bir şekilde yanıt vermelerini sağlayan çok sayıda hücre yüzeyi reseptörünü eksprese eder11,12 ve enfeksiyonlar veya doku hasarı 12,13,14 ve ayrıca multipl skleroz(MS) gibi nörodejeneratif hastalıklar 9,15 sırasında inflamatuar yanıtları teşvik etmelerini sağlar16,17. Mikroglia ayrıca çeşitli nörotransmiterlere ve nöropeptitlere 18,19,20 reseptörleri eksprese eder, bu da nöronal aktiviteye21,22 yanıt verebileceklerini ve düzenleyebileceklerini düşündürür. Gerçekten de, mikroglia ve nöronlar, zar proteinlerinin aracılık ettiği doğrudan etkileşimler veya çözünür faktörlerveya ara hücreler23,24 aracılığıyla dolaylı etkileşimler gibi çeşitli çift yönlü iletişim biçimlerinde8,23 etkileşime girer.
Örneğin, nöronlar tarafından salgılanan çeşitli nörotransmiterler, mikroglia25,26,27’nin nöroprotektif veya inflamatuar aktivitesini modüle edebilir. Ek olarak, nöronlar ve mikroglia arasındaki doğrudan etkileşimler, mikroglia’nın homeostatik bir durumda tutulmasına yardımcı olur28. Tersine, mikroglia’nın nöronlarla doğrudan etkileşimleri, nöronal devreyi29 şekillendirebilir ve nöronal sinyalleşmeyi 30,31,32 etkileyebilir. Bu etkileşimlerin bozulması nöronların30 hipereksitabilitesini ve mikroglia reaktivitesini33,34 indüklediğinden, düzensiz mikroglia-nöronal etkileşimler nörolojik hastalıklara katkıda bulunan bir faktör olarak rol oynar33,35. Gerçekten de, psikotik23,26 ve nörodejeneratif hastalıkların işlevsiz mikroglia-nöronal etkileşimler sergilediği tanımlanmıştır33. Bu gözlemler CNS’de mikroglia-nöronal iletişimin önemini vurgularken, bu etkileşimlerin sağlık ve hastalıkta mikroglial ve nöronal fonksiyonları nasıl düzenlediğine dair spesifik mekanizmalar nispeten bilinmemektedir.
CNS gibi karmaşık bir ortamda, çoklu çevresel faktörler mikroglia-nöronal etkileşimleri etkileyebilir ve bu da geçici hücresel etkileşimleri in vivo olarak inceleme yeteneğini sınırlar. Burada, mikroglia ve nöronlar arasındaki doğrudan hücresel etkileşimleri incelemek için kullanılabilecek bir in vitro mikroglia-nöronal ko-kültür sistemi sunuyoruz. Bu protokol, doğum sonrası 0-2. günler ve embriyonik farelerin 16-18. günleri arasında yenidoğan farelerin kortekslerinden birincil mikroglia ve nöronların oluşumunu tanımlar. Nöronlar ve mikroglia daha sonra aşağı akış yüksek verimli deneyler için 96 oyuklu plakalarda birlikte kültürlenir. Daha önce bu yaklaşımı, mikroglia fagositozunun nöronları oksitlenmiş fosfatidilkolin aracılı hücre ölümünden37 koruduğunu göstermek için kullandık, bu da bu yöntemin nörodejenerasyon ve MS bağlamında mikroglia’nın rollerini anlamaya yardımcı olabileceğini düşündürdü. Benzer şekilde, mikroglia-nöronal ko-kültürler, viral enfeksiyonlar38 veya nöronal yaralanma ve onarım39 gibi diğer bağlamlarda mikroglia-nöronal karışmanın etkisini araştırmak için de yararlı olabilir. Genel olarak, in vitro mikroglia-nöronal ko-kültür sistemleri, araştırmacıların in vivo modelleri tamamlayan manipüle edilebilir ve kontrollü bir ortamda mikroglia-nöronal etkileşimleri incelemelerini sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, daha sonra mikroglia ve nöron etkileşimlerinin hücresel sağlıklarını ve işlevlerini nasıl düzenlediğini incelemek için kullanılabilecek bir mikroglia-nöronal ko-kültür oluşturmak için kullanılan fare birincil nöronlarını ve birincil mikroglialarını izole etmek ve kültürlemek için bir protokolü açıklamaktadır. Bu nispeten basit ve erişilebilir yaklaşım, CNS’deki mikroglia nöron etkileşimlerinin mekanizmaları ve işlevsel sonuçları hakkında kritik bilgiler sağlayabilir.</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JP, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi ve Saskatchewan Üniversitesi Tıp Fakültesi’nden fon desteğini kabul eder. YD, Saskatchewan Üniversitesi Tıp Fakültesi Başlangıç Fonu, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Keşif Hibesi (RGPIN-2023-03659), MS Kanada Katalizör Hibesi (1019973), Saskatchewan Sağlık Araştırma Vakfı Kuruluş Hibesi (6368) ve Brain Canada Vakfı Kanada Beyin Araştırmalarında Geleceğin Liderleri Hibesi. Şekil 1A, Şekil 2A ve Şekil 3A BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| 10 cm Petri dish | Fisher | 07-202-011 | Sterile |
| 1x Versene | Gibco | 15040-066 | |
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | |
| Dissection microscope | VWR | ||
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Sci | 12483-020 | |
| HBSS (10x) | Gibco | 14065-056 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| HEPES | ThermoFisher Sci | 15630080 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium (1x) | Fisher Scientific | 21083027 | |
| Macrophage colony stimulating factor | Peprotech | 315-02 | |
| Micro-Forceps | RWD | F11020-11 | Autoclaved/Sterile |
| Non-essential amino acids | Cytiva | SH3023801 | |
| PBS (10x) | ThermoFisher Sci | AM9625 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamine (100x) | Gibco | 103780-16 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma | P3655-100MG | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Spring scissors | RWD | S11008-42 | Autoclaved/Sterile |
| Surgical blade | Feather | 08-916-5D | Sterile |
| T-25 flasks | Fisher | 10-126-9 | |
| T-75 flasks | Fisher | 13-680-65 | |
| Tissue forceps | Codman | 30-4218 | Autoclaved/Sterile |
| Tissue scissors | RWD | S12052-10 | Autoclaved/Sterile |
| Trypan Blue | Thermofisher Sci | 15250-061 | |
| Trypsin (2.5%) | ThermoFisher Sci | 15090046 | |
| Widefield Immunofluorescence Microscope | Zeiss |
Riferimenti
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. J Immunol Res. 2017, 1-12 (2017).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
- Ginhoux, F., Prinz, M. Origin of microglia: Current concepts and past controversies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (8), a020537 (2015).
- Dermitzakis, I., et al. Origin and emergence of microglia in the CNS-an interesting (hi)story of an eccentric cell. Curr Issues Mol Biol. 45 (3), 2609-2628 (2023).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Askew, K., et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 18 (2), 391-405 (2017).
- Vidal-Itriago, A., et al. Microglia morphophysiological diversity and its implications for the CNS. Front Immunol. 13, 997786 (2022).
- Wendimu, M. Y., Hooks, S. B. Microglia phenotypes in aging and neurodegenerative diseases. Cells. 11 (13), 2091 (2022).
- Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
- Zhao, J. F., et al. Research progress on the role of microglia membrane proteins or receptors in neuroinflammation and degeneration. Front Cell Neurosci. 16, 831977 (2022).
- Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The role of microglia in central nervous system immunity and glioma immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
- Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198 (2020).
- Doens, D., Fernández, P. L. Microglia receptors and their implications in the response to amyloid β for Alzheimer’s disease pathogenesis. J Neuroinflammation. 11 (1), 48 (2014).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
- Fischer, M. T., et al. NADPH oxidase expression in active multiple sclerosis lesions in relation to oxidative tissue damage and mitochondrial injury. Brain. 135 (3), 886-899 (2012).
- Marinelli, S., Basilico, B., Marrone, M. C., Ragozzino, D. Microglia-neuron crosstalk: Signaling mechanism and control of synaptic transmission. Semin Cell Dev Biol. 94, 138-151 (2019).
- Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
- Carniglia, L., et al. Neuropeptides and microglial activation in inflammation, pain, and neurodegenerative diseases. Mediators Inflamm. 2017, 5048616 (2017).
- Zhao, S., Umpierre, A. D., Wu, L. J. Tuning neural circuits and behaviors by microglia in the adult brain. Trends Neurosci. 47 (3), 181-194 (2024).
- Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: New roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
- Haidar, M. A., et al. Crosstalk between microglia and neurons in neurotrauma: An overview of the underlying mechanisms. Curr Neuropharmacol. 20 (11), 2050-2065 (2022).
- Cserép, C., Pósfai, B., Dénes, &. #. 1. 9. 3. ;. Shaping neuronal fate: Functional heterogeneity of direct microglia-neuron interactions. Neuron. 109 (2), 222-240 (2021).
- Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
- Eyo, U. B., Wu, L. J. Bidirectional microglia-neuron communication in the healthy brain. Neural Plast. 2013, 456857 (2013).
- Strosznajder, J. B., Czapski, G. A. Glutamate and GABA in microglia-neuron cross-talk in Alzheimer’s disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11677 (2021).
- Lyons, A., et al. CD200 ligand-receptor interaction modulates microglial activation in vivo and in vitro A role for IL-4. J Neurosci. 27 (31), 8309-8313 (2007).
- Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: Actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends Neurosci. 36 (4), 209-217 (2013).
- Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nat Neurosci. 24 (1), 19-23 (2021).
- Chen, Z., et al. Microglial displacement of inhibitory synapses provides neuroprotection in the adult brain. Nat Commun. 5 (1), 4486 (2014).
- Cantaut-Belarif, Y., et al. Microglia control the glycinergic but not the GABAergic synapses via prostaglandin E2 in the spinal cord. J Cell Biol. 216 (9), 2979-2989 (2017).
- Szepesi, Z., Manouchehrian, O., Bachiller, S., Deierborg, T. Bidirectional microglia-neuron communication in health and disease. Front Cell Neurosci. 12, 323 (2018).
- Chamera, K., Trojan, E., Szuster-Głuszczak, M., Basta-Kaim, A. The potential role of dysfunctions in neuron-microglia communication in the pathogenesis of brain disorders. Curr Neuropharmacol. 18 (5), 408-430 (2020).
- Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: Mechanism and potential therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 359 (2023).
- Brisch, R., et al. The role of microglia in neuropsychiatric disorders and suicide. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 272 (6), 929-945 (2022).
- Dong, Y., et al. Oxidized phosphatidylcholines found in multiple sclerosis lesions mediate neurodegeneration and are neutralized by microglia. Nat Neurosci. 24 (4), 489-503 (2021).
- Alvarez-Carbonell, D., et al. Cross-talk between microglia and neurons regulates HIV latency. PLoS Pathog. 15 (12), e1008249 (2019).
- Lorenzen, K., et al. Microglia induce neurogenic protein expression in primary cortical cells by stimulating PI3K/AKT intracellular signaling in vitro. Mol Biol Rep. 48 (1), 563-584 (2021).
- Güler, B. E., Krzysko, J., Wolfrum, U. Isolation and culturing of primary mouse astrocytes for the analysis of focal adhesion dynamics. STAR Protoc. 2 (4), 100954 (2021).
- Tomassoni-Ardori, F., Hong, Z., Fulgenzi, G., Tessarollo, L. Generation of functional mouse hippocampal neurons. Bio Protoc. 10 (15), e3702 (2020).
- Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2.7), (2006).
- Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-culture of neurons and microglia. Curr Protoc Toxicol. 74, 11.24.1-11.24.17 (2017).
- Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 155 (2020).
- Carroll, J. A., Foliaki, S. T., Haigh, C. L. A 3D cell culture approach for studying neuroinflammation. J Neurosci Methods. 358, 109201 (2021).
- Baxter, P. S., et al. Microglial identity and inflammatory responses are controlled by the combined effects of neurons and astrocytes. Cell Rep. 34 (12), 108882 (2021).
- Luchena, C., et al. A neuron, microglia, and astrocyte triple co-culture model to study Alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 844534 (2022).
- Park, J., et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer’s disease. Nat Neurosci. 21 (7), 941-951 (2018).
- Vahsen, B. F., et al. Human iPSC co-culture model to investigate the interaction between microglia and motor neurons. Sci Rep. 12 (1), 12606 (2022).
- Giacomelli, E., et al. Human stem cell models of neurodegeneration: from basic science of amyotrophic lateral sclerosis to clinical translation. Cell Stem Cell. 29 (1), 11-35 (2022).
- Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: relationship to neurodegeneration and therapeutics. J Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Dong, Y., Lozinski, B. M., Silva, C., Yong, V. W. Studying the microglia response to oxidized phosphatidylcholine in primary mouse neuron culture and mouse spinal cord. STAR Protoc. 2 (4), 100853 (2021).
- Anderson, S. R., et al. Neuronal apoptosis drives remodeling states of microglia and shifts in survival pathway dependence. eLife. 11, e76564 (2022).
- Harry, G. J., McPherson, C. A. Microglia: Neuroprotective and neurodestructive properties. Handbook of Neurotoxicity. , 109-132 (2014).
.