완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석
Summary
당사는 광학 트랩에 고정된 선형 DNA 분자에서 형광 라벨링되고 완전히 재구성된 Cdc45/Mcm2-7/GINS(CMG) 헬리카제의 움직임을 직접 이미지화하고 정량화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석을 보고합니다.
Abstract
진핵생물은 CMG로 알려진 하나의 복제 헬리카제를 가지고 있으며, 이 헬리카제는 중앙에서 레플리솜을 조직하고 구동하며 복제 포크의 앞쪽에서 앞장섭니다. CMG의 역학에 대한 심층적인 기계론적 이해를 얻는 것은 세포가 세포 주기당 한 번씩 전체 게놈을 효율적이고 정확하게 복제하는 엄청난 작업을 어떻게 달성하는지 설명하는 데 중요합니다. 단일 분자 기술은 비교할 수 없는 시간적, 공간적 해상도로 인해 CMG의 역학을 정량화하는 데 매우 적합합니다. 그럼에도 불구하고, CMG 움직임에 대한 단일 분자 연구는 지금까지 복합체로 세포에서 정제된 미리 형성된 CMG에 의존해 왔으며, 이로 인해 CMG의 활성화에 이르는 단계에 대한 연구가 불가능했습니다. 여기에서는 36개의 서로 다른 정제된 S. cerevisiae 폴리펩타이드로부터 조립 및 활성화를 완전히 재구성한 후 형광 표지된 CMG의 단일 분자 수준에서 움직임의 단일 분자 수준에서 이미징을 가능하게 한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 두 개의 직교 부착 부분이 있는 선형 DNA 기질 말단의 이중 기능화에 의존하며, 단일 분자 수준에서 유사하게 복잡한 DNA 처리 메커니즘을 연구하도록 조정할 수 있습니다.
Introduction
진핵생물의 DNA 복제는 리플리솜1로 알려진 동적 단백질 복합체에 의해 수행됩니다. 이 복합체의 핵심 구성 요소는 진핵 복제 헬리케이스 Cdc45/MCM2-7/GINS(CMG)로, 복제 포크 1,2의 전면에 앞장서서 레플리솜을 구동하고 중앙에서 조직합니다. 따라서 CMG의 동역학에 대한 심층적인 정량적 이해를 얻는 것은 리플리솜의 동역학을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이러한 이해는 타의 추종을 불허하는 공간 및 시간 해상도로 인해 CMG와 같은 분자 모터를 연구하는 데 특히 적합한 단일 분자 기술을 통해 얻을 수 있으며 기능, 확률 및 역학 2,3,4,5,6,7,8,9에 대한 비할 데 없는 정량적 이해를 제공할 수 있습니다.
생체 내에서 CMG는 복제가 세포 주기 1,10,11당 한 번만 발생하도록 하기 위해 시간적으로 분리된 방식으로 로드되고 활성화됩니다. 첫째, 세포 주기의 G1 단계에서 로딩 인자로 알려진 단백질 세트는 CMG의 첫 번째 구성 요소인 MCM2-7 헥사메릭 복합체를 일대일 구성15,17,18을 가진 이중 헥사머 형태로 dsDNA 12,13,14,15,16에 로드합니다. 효모의 특정 경우, 이 초기 과정은 복제의 기원(origins of replication)1으로 알려진 특정 DNA 염기서열에서 발생한다. Mcm2-7이 복제 헬리카제의 모터 코어이지만, 완전히 활성화된 CMG 11,19,20,21을 생성하기 위해 로드된 MCM2-7에 모집되어야 하는 두 개의 헬리카제 활성화 인자 Cdc45 및 GINS 없이는 그 자체로 DNA 19를 풀 수 없습니다. helicase 활성화 과정은 세포주기의 S 단계에서 발생하며 세포주기 조절 키나아제 DDK 22,23,24에 의한 Mcm2-7 이중 헥사머의 선택적 인산화로 시작됩니다. 이러한 인산화 이벤트는 발화 인자10,11,26으로 알려진 두 번째 단백질 세트에 의해 Cdc45 및 GINS가 MCM2-7 이중 헥사머 10,22,23,24,25,26에 모집되는 것을 용이하게 합니다. Cdc45 및 GINS의 결합은 두 개의 자매 CMG 헬리케이스를 생성하며, 이들은 처음에는 부모 DNA의 두 가닥을 모두 둘러싸고 여전히 일대일 구성(11,27)에 위치합니다. 최종 활성화 단계에서, 발화 인자 MCM10은 각 자매 CMG11로부터 하나의 DNA 가닥의 ATP 가수분해 의존성 압출을 촉매한다. 스트랜드 압출 후, 자매 CMG 헬리케이스는 ATP 가수분해 의존적 방식(11,20,21,28)으로 ssDNA를 따라 전위함으로써 서로 우회 및 분리되고, 비전위 스트랜드(29)를 입체적으로 배제함으로써 DNA를 풀었다. 이 전체 공정은 36개의 정제된 S. cerevisiae 폴리펩티드 10,11의 최소 세트로부터 시험관내에서 완전히 재구성되었습니다.
위에서 설명한 CMG 조립 및 활성화의 정교한 생체 내 조절에도 불구하고, CMG 2,30,31,32,33,34의 시험관 내 재구성 단일 분자 운동 연구는 지금까지 세포20,21에서 복합체로 정제된 사전 활성화된 CMG에 의존해 왔습니다, 활성화 이전의 모든 단계와 동작의 양방향 특성이 누락되었습니다. 이 사전 활성화된 CMG 접근법은 부분적으로 완전히 재구성된 CMG 조립 반응10,11의 생화학적 복잡성으로 인해 단일 분자 분야의 황금 표준이 되었습니다. 이 생화학 반응은 여러 가지 이유로 벌크 생화학 수준에서 단일 분자 수준으로 전환하기가 어려웠습니다. 첫째, 반응 효율을 극대화하기 위해 CMG 조립 및 활성화에 필요한 로딩 및 소성 인자는 10-200 nM10,11,27 범위의 농도에서 필요합니다. 이러한 농도 범위는 대부분의 단일분자 기술이 허용할 수 있는 것의 최고점에 해당하며, 특히 형광으로 표지된 성분(35)을 사용할 때 더욱 그러하다. 마지막으로, CMG는 셀 36,37,38,39에서 수천 개의 염기쌍을 순항하도록 진화했습니다. 따라서 생물학적으로 관련된 공간 규모에서 그 움직임을 연구하려면 긴 DNA 기질(일반적으로 수십 킬로베이스 정도의 길이)이 필요합니다.30,31,34,40,41,42. 이러한 긴 DNA 기질을 사용하는 것은 DNA 기질이 길수록 단백질 및 단백질 응집체에 대한 잠재적인 비특이적 결합 부위가 더 많아진다는 추가적인 문제를 제기합니다. CMG의 경우, 후자의 점이 특히 중요한데, CMG 조립 및 활성화에 관련된 여러 로딩 및 발화 인자는 본질적으로 무질서한 영역(43)을 포함하고 응집되기 쉽기 때문이다.
여기에서는 36개의 정제된 S. cerevisiae 폴리펩티드28에서 조립 및 활성화를 완전히 재구성한 후 CMG의 움직임을 관찰하고 정량화할 수 있는 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석을 보고합니다. 이 분석은 두 개의 직교 부착 부분인 desthiobiotin 및 digoxigenin2 가 있는 DNA 기질의 양쪽 말단의 이중 기능화에 의존합니다(그림 1A). 첫 번째 부분인 데스티오비오틴(desthiobiotin)은 DNA 기질을 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드(44 )에 가역적으로 결합하는 데 사용됩니다(그림 1B). 그런 다음 형광 표지된 CMG를 비드 결합 DNA에 조립하고 활성화하며, 마그네틱 랙을 사용하여 생성된 마그네틱 비드 결합 DNA:CMG 복합체를 정제하고 세척합니다(그림 1C). 그렇게 함으로써, 그렇지 않으면 DNA 기질에 응집될 과잉 단백질이 제거됩니다. 이는 사실상 응집체가 없는 DNA:CMG 복합체를 제공합니다. 그런 다음 원형(intact) 복합체는 데스티오비오틴(desthiobiotin)-스트렙타비딘(streptavidin) 상호작용을 능가할 수 있는 과도한 유리 비오틴(free biotin)을 몰 과도하게 첨가하여 마그네틱 비드에서 용리됩니다(그림 1D). 개별 DNA:CMG 복합체는 항-디곡시제닌 항체(anti-Dig)로 코팅된 두 개의 광학적으로 포획된 폴리스티렌 비드 사이에 결합됩니다. 이 단계에서는 DNA의 두 번째 부분인 디곡시제닌(digoxigenin)이 사용되는데, 이는 유리 비오틴이 과도하게 함유된 완충 용액에서도 anti-Dig에 결합할 수 있기 때문입니다(그림 1E). DNA:CMG 복합체가 광학 트랩에 고정되면 형광 표지된 CMG의 움직임을 컨포칼 스캐닝 레이저로 이미지화합니다(그림 1F). 우리는 이 분석법이 유사하게 복잡한 DNA:단백질 상호 작용의 단일 분자 수준에서 연구에 쉽게 적용할 수 있을 것으로 예상합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
중요한 단계 및 중요한 시약 품질 검사
분석의 중요한 단계와 생물학적 시약 품질 검사가 여기에 강조되어 있습니다. 첫째, 단백질 샘플에서 작은 뉴클레아제 오염 물질로 인한 DNA 분해도 데이터에 부정적인 영향을 미치기 때문에 사용되는 단백질의 순도가 중요합니다. 이는 온전한(또는 부분적으로 흠집이 있는) DNA 분자만 이중 빔 광학 핀셋에 갇힐 수 있기 때문입니다. 더 중요한 것은, DNA에 흠집이 생기면 CMG가41을 해리하게 되어 CMG의 장거리 운동 관찰이 복잡해진다는 것이다. 정제된 각 단백질의 뉴클레아제 활성을 테스트하고 시작 플라스미드 기질의 무결성을 지속적으로 모니터링하여 흠집이 최소화되도록 하는 것이 좋습니다. 두 번째 중요한 단계는 DNA:CMG 복합체를 용출한 후 자성 비드를 조심스럽게 제거하는 것입니다. 이 단계에서 상층액 제거는 수집된 비드를 방해하지 않도록 천천히 수행해야 합니다. 광학 핀셋으로 날아간 샘플에 자성 비드가 남아 있으면 광학적으로 포집된 폴리스티렌 비드에 부딪혀 광학 트랩을 빠져나가고 데이터 수집이 복잡해집니다. 마지막으로, DNA:CMG 복합체는 광학 핀셋에서 조심스럽게 다루어야 합니다. 이를 위해 힘을 가하면 DNA에서 CMG가 분리될 수 있으므로 DNA의 장력을 10pN 이상으로 높이지 않는 것이 좋습니다. 또한, 미세유체 플로우 셀의 채널 간 이동은 결과적으로 발생하는 항력으로 인해 DNA에서 CMG가 해리되는 것을 방지하기 위해 가능한 한 천천히(~ 0.2mm/s) 수행되어야 합니다.
방법의 수정
수정할 수 있는 분석에는 여러 단계가 있습니다. 예를 들어, 용리 수율에 큰 영향을 주지 않고 용출 시간을 60분에서 30분으로 줄일 수 있음을 보여주었습니다. 또한 CMG가 DNA 말단에서 확산되는 것을 방지하고 일반적으로 CMG28을 안정화하기 위해 ATP 또는 ATPγS의 낮은(1mM 미만) 농도로 용리 버퍼를 보충하는 것이 좋습니다. 또한, 여기에서 보고하는 완충액 조성 및 단백질 농도는 이전의 앙상블 생화학 및 단일 분자 작업11,18에서 사용된 것을 기반으로 하지만, 우리가 설명하는 분석은 CMG26,27을 조립하기 위한 다른 프로토콜과 완전히 호환됩니다. 따라서 CMG 조립 또는 활성화의 효율성을 증가시키는 것으로 보고된 모든 생화학적 발전은 수율을 높이기 위해 분석의 벌크 부분에서 구현될 수 있고 구현되어야 합니다. 마지막으로, 프레임 사이의 시간을 늘리면 CMG를 이미징할 수 있는 총 시간이 증가하여 형광단 표백 전에 장거리 CMG 움직임을 쉽게 관찰할 수 있습니다.
방법의 한계
우리가 설명하는 하이브리드 방법은 대량으로 활성화된 CMG만 이미지화할 수 있다는 점에서 제한적입니다. CMG의 활성화를 실시간으로 관찰하려면 추가 작업이 필요합니다. 또 다른 중요한 제한 사항은 CMG가 쌍 17,26,27로 조립될 것으로 예상하지만, 우리가 관찰하는 DNA당 CMG 복합체의 총 수는 대부분 1개(28)이며, 이는 CMG 또는 적어도 Cdc45가 민감한 DNA:CMG 복합체를 처리하는 동안 DNA에서 해리되고 있음을 시사합니다. 단일 분자 이미징 전에 처리 단계 수를 줄이고 미세유체 플로우 셀의 플라스틱 튜브 및 유리에 대한 더 나은 패시베이션 전략을 개발하면 이러한 수율을 높일 수 있습니다.
이 방법의 의의
CMG의 단일 분자 움직임 연구는 지금까지 세포에서 복합체로 정제된 사전 활성화된 CMG를 사용했습니다. 상대적으로 더 간단하지만 이 미리 활성화된 CMG 접근 방식은 CMG 활성화로 이어지는 단계와 CMG 및 의존성 동작의 양방향 특성을 놓친다는 점에서 제한적입니다. 반면에 CMG 어셈블리 및 활성화의 전체 재구성은 모든 사전 활성화 단계를 연구할 수 있을 뿐만 아니라 양방향 방식으로 CMG 동작을 연구할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이 접근법은 벌크 생화학 수준에서 단일 분자 수준으로 변환하기가 더 어렵습니다., 훨씬 더 많은 정제된 단백질 요인과 단계를 포함하기 때문입니다. 여기에서 설명하는 분석은 단일 분자 수준에서 완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화할 수 있게 함으로써 이러한 문제를 극복하는 데 도움이 되었으며, 이를 통해 이전에 놓쳤던 일부 사전 활성화 역학28에 액세스할 수 있습니다. 또한 대부분 DNA당 하나의 CMG를 볼 수 있지만 두 개의 CMG 복합체가 반대 방향으로 이동하는 여러 인스턴스를 관찰할 수 있었고 자매 CMG가 서로28에서 처음 분리되는 것을 캡처할 수도 있어 양방향 복제 설정에 대한 몇 가지 통찰력을 제공할 수 있었습니다.
이전 CMG motion과 비교했을 때 이 분석의 또 다른 장점은 우리가 사용하는 DNA 기질의 완전한 이중 가닥 특성에 있습니다(그림 1A). 이전의 사전 활성화된 CMG 작업에서 CMG를 DNA 기질에 결합하는 가장 일반적인 방법은 3′ ssDNA 플랩을 통하는 것입니다. 이로 인해 비틀림으로 쉽게 제약될 수 없는 DNA 구조가 생성되며, 따라서 replisome progression에서 supercoiling의 역할에 대한 연구를 금지합니다. 반대로, 여기에서 설명하는 새로운 접근 방식은 사용된 DNA 기질이 완전히 이중 가닥이기 때문에 이 과정에서 토크의 역할을 연구하는 데 적용할 수 있는 잠재력을 가질 수 있습니다.
이 방법의 광범위한 응용 프로그램
설명된 하이브리드 분석은 완전한 진핵생물 replisome의 완전한 재구성을 향한 길을 열어 당사와 다른 사람들이 replisome이 모든 다른 작업에서 성공할 수 있도록 하는 중요한 역학을 관찰하고 정량화할 수 있도록 합니다. DNA 복제는 제쳐두고, 우리가 보고하는 분석은 복잡한 생화학 반응을 벌크 생화학에서 단일 분자 수준으로 변환하는 데 중요한 발전을 나타냅니다. 우리는 이 분석법이 다른 DNA 처리 기계장치에서 연루된 유사한 복잡한 DNA:단백질 상호 작용을 공부하기 위하여 쉽게 수정될 수 있을 것으로 예상합니다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 라벨링되지 않은 단백질의 과발현을 위한 효모 균주를 제공한 Anne Early, Lucy Drury 및 Max Douglas와 로딩 팩터 및 DDK를 정제하는 데 도움을 준 N.D. 실험실 구성원인 Anuj Kumar, Katinka Ligthart 및 Julien Gros에게 감사를 표합니다. 저자들은 또한 유용한 과학적 토론을 해준 Kaley McCluskey, Dorian Mikolajczak, Joseph Yeeles, Jacob Lewis, Alessandro Costa, Hasan Yardimci, Taekjip Ha에게 감사를 표한다. DRM은 Boehringer Ingelheim Fonds PhD Fellowship의 자금 지원을 인정합니다. ND는 Top Grant 714.017.002를 통해 네덜란드 과학 연구 기구(NWO)로부터, Advanced Grant(REPLICHROMA, 보조금 번호 789267)를 통해 European Research Council으로부터 자금을 지원받은 것을 인정합니다.
Materials
| AflII | NEB | R0520L | |
| Anti-digoxigenin coated polystyrene beads | Spheroteck | DIGP-20-2 | |
| ATP solution | Thermo Fisher | R0441 | |
| ATPγS | Roche | 11162306001 | |
| BSA | NEB | B9000S | |
| C-Trap | Lumicks | ||
| CutSmart Buffer | NEB | B6004S | Provided with AflII |
| dCTP | Promega | U122B | |
| D-Desthiobiotin-7-dATP | Jena Bioscience | NU-835-Desthiobio | |
| dGTP | Thermo Fisher | 10218014 | |
| Digoxigenin-11-dUTP | Jena Bioscience | NU-803-DIGXL | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin magnetic beads | Invitrogen | 11205D | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| Microspin S-400 HR spin columns | GE Healthcare | GE27-5140-01 | |
| NEBuffer2 | NEB | B7002S | Provided with Klenow Fragment |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 |
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